يتم استخدام تفاعل البلمرة المتسلسل PCR. تفاعل البوليميراز المتسلسل، جوهره ومجالات تطبيقه. كيفية الاستعداد للاختبار

يوفر الموقع معلومات مرجعية لأغراض إعلامية فقط. ويجب أن يتم تشخيص وعلاج الأمراض تحت إشراف أخصائي. جميع الأدوية لها موانع. مطلوب التشاور مع متخصص!

طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسلتم اكتشافه منذ ما يقرب من ثلاثين عامًا على يد عالم أمريكي اسمه كاري موليس. وتستخدم هذه التقنية على نطاق واسع في الطب كأداة تشخيصية، وجوهرها هو نسخ جزء من الحمض النووي باستخدام إنزيم خاص ( البوليميرات) بشكل مصطنع في المختبر.

في أي مجالات الطب تستخدم هذه الطريقة؟

لماذا يتم إجراء نسخ الحمض النووي وكيف يمكن أن يخدم الطب؟
تسمح هذه التقنية بما يلي:

• عزل واستنساخ الجينات.
• تشخيص الأمراض الوراثية والمعدية.
• تحديد الأبوة. يرث الطفل بعض خصائصه الجينية من والديه البيولوجيين، ولكن لديه هويته الجينية الفريدة. إن وجود بعض الجينات المطابقة لجينات الوالدين يسمح لنا بالحديث عن إقامة علاقة.

يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل أيضًا في ممارسة الطب الشرعي.

في مسرح الجريمة، يقوم علماء الطب الشرعي بجمع عينات من المواد الوراثية. ومنها: الشعر، واللعاب، والدم. وبعد ذلك، وبفضل تقنية تفاعل البوليميراز، يمكن تضخيم الحمض النووي ومقارنة هوية العينة المأخوذة مع المادة الوراثية للشخص المشتبه فيه.

يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل فعال في الطب:

• في الممارسة الرئوية - للتمييز بين الأنواع البكتيرية والفيروسية من الالتهاب الرئوي والسل.
• في ممارسة أمراض النساء والمسالك البولية - لتحديد ureaplasmosis، الكلاميديا، عدوى الميكوبلازما، gardnerellosis، الهربس، السيلان.
• في ممارسة أمراض الجهاز الهضمي.
• في أمراض الدم - لتحديد الفيروسات الورمية وعدوى الفيروس المضخم للخلايا.
• في التشخيص السريع للأمراض المعدية مثل التهاب الكبد الفيروسي والدفتيريا والسالمونيلات.

حاليا، هذه الطريقة هي الأكثر شيوعا في تشخيص الأمراض المعدية ( التهاب الكبد الفيروسي، فيروس نقص المناعة البشرية، الأمراض المنقولة جنسيا، السل، التهاب الدماغ الذي ينقله القراد).

ماذا يحدث أثناء رد الفعل؟

التفاعل نفسه بسيط كيميائيا. يمكن أن يكون مصدر الحمض النووي للتفاعل هو قطرة دم، أو شعر، أو قطعة من الجلد، وما إلى ذلك. من الناحية النظرية، يتطلب التفاعل الكواشف اللازمة وأنبوب اختبار وعينة بيولوجية ومصدرًا للحرارة.

يتيح تفاعل البوليميراز اكتشاف العدوى، حتى لو كانت العينة التي تحتوي على مادة بيولوجية تحتوي على جزيء واحد أو أكثر من جزيئات الحمض النووي للعامل الممرض.

أثناء التفاعل، وبفضل إنزيم بوليميراز الحمض النووي، تحدث عملية مضاعفة ( تكرار) قسم من الحمض النووي. حمض الديوكسي ريبونوكلييك نفسه ( يتم اختصاره كـ DNA) مهم بالنسبة لنا لأنه يضمن تخزين ونقل المعلومات الوراثية إلى الخلايا الوليدة. الحمض النووي له شكل حلزوني يتكون من كتل متكررة. تشكل هذه الكتل النيوكليوتيدات، وهي أصغر وحدة من الحمض النووي. تتشكل النيوكليوتيدات من الأحماض الأمينية.

تحدث عملية تكرار أقسام الحمض النووي خلال دورات متكررة. في كل دورة من هذه الدورات، لا يتم فقط نسخ جزء الحمض النووي الأصلي ومضاعفته، ولكن أيضًا تلك الأجزاء التي تمت مضاعفتها بالفعل في دورة التضخيم السابقة. كل هذا يشبه عملية التقدم الهندسي.

موجود:

• التضخيم الطبيعي ( أي عملية نسخ وتكاثر الحمض النووي) والتي تحدث في أجسامنا وهي عملية حتمية ومحددة مسبقًا.
• التضخيم الاصطناعي، والذي يحدث بسبب تفاعل البوليميراز المتسلسل. في هذه الحالة، يتم التحكم في عملية النسخ وتسمح بتكرار مقاطع قصيرة من الحمض النووي.

بعد اكتمال كل دورة نسخ، يزداد عدد شظايا الحمض النووي بشكل كبير. ولهذا السبب تسمى العملية نفسها "التفاعل المتسلسل".

وبعد ثلاثين إلى أربعين دورة، يصل عدد الأجزاء إلى عدة مليارات.

للتضخيم في المختبر (في المختبر) من الضروري أن يكون هناك جزء معين من الحمض النووي الأجنبي ( أي أن الحمض النووي ليس للمريض، بل للعامل الممرض). إذا كان المحلول الذي تم إنشاؤه لا يحتوي على جزء محدد، فلن يحدث التفاعل المتسلسل تحت تأثير البوليميراز. وهذا ما يفسر حقيقة الخصوصية العالية لـ PCR.

مراحل تشخيص PCR

1. يتم عزل الحمض النووي من المادة قيد الدراسة.
2. يضاف الحمض النووي إلى محلول خاص من النيوكليوتيدات.
3. يتم تسخين المحلول إلى درجة حرارة 90 - 95 درجة مئوية حتى يتخثر بروتين الحمض النووي.
4. خفض درجة الحرارة إلى 60 درجة.
5. مع تكرار دورات زيادة وانخفاض درجة الحرارة، يزداد عدد مواقع الحمض النووي.

6. ومن خلال إجراء الترحيل الكهربائي، يتم تلخيص النتائج وحساب نتائج المضاعفة.

ما هي مزايا هذا التشخيص؟

• تعدد الاستخدامات: أي عينة من الحمض النووي مناسبة لهذه الطريقة.
• خصوصية عالية: يمتلك العامل الممرض تسلسلات فريدة من سلاسل الحمض النووي الخاصة به. ولذلك فإن نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل ستكون موثوقة، ومن المستحيل الخلط بين جين أحد مسببات الأمراض وجين ممرض آخر.
• الحساسية لوجود ولو جزيء واحد من مسببات الأمراض.

• كمية صغيرة من المواد اللازمة للبحث. حتى قطرة دم ستفي بالغرض. تعد القدرة على الحصول على النتائج باستخدام الحد الأدنى من حجم العينة أمرًا مهمًا جدًا لدراسات طب الأطفال وحديثي الولادة والعصبية، وكذلك في ممارسة الطب الشرعي.
• القدرة على تحديد العدوى الخاملة والمزمنة وليست الحادة فقط.
• من الصعب جدًا زراعة العديد من المزارع المسببة للأمراض في المختبر باستخدام طرق أخرى، لكن تفاعل البوليميراز يسمح بنشر المزرعة بالكمية المطلوبة.

ما هي عيوب هذا التشخيص؟

• إذا كانت المادة المخصصة لتفاعل البوليميراز المتسلسل تحتوي على الحمض النووي ليس فقط لمسبب المرض الحي، ولكن أيضًا لمسبب المرض الميت، فسيحدث تضخيم كلا الحمضين النوويين. وبناء على ذلك فإن العلاج الموصوف بعد التشخيص قد لا يكون صحيحا تماما. بعد مرور بعض الوقت، من الأفضل مراقبة فعالية العلاج.
• يمكن أيضًا اعتبار الحساسية المتزايدة لوجود الكائنات الحية الدقيقة عيبًا بطريقة ما. بعد كل شيء، يحتوي جسم الإنسان عادة على نباتات دقيقة انتهازية، أي أنها كائنات حية دقيقة تعيش في الأمعاء والمعدة والأعضاء الداخلية الأخرى. يمكن لهذه الكائنات الحية الدقيقة أن تسبب ضررًا للإنسان فقط في ظل ظروف غير مواتية معينة - عدم الامتثال لمتطلبات النظافة، ومياه الشرب الملوثة، وما إلى ذلك. تعمل تقنية PCR على تضخيم الحمض النووي حتى لهذه الكائنات الحية الدقيقة، على الرغم من أنها لا تؤدي إلى علم الأمراض.
• قد يُظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لأنظمة الاختبار المختلفة نتائج تختلف عن بعضها البعض. هناك العديد من التعديلات على هذه التقنية: " متداخلة», « غير متماثل», « معكوسة», « كمي» PCR وغيرها.

يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) طريقة عالية الدقة في مجال تشخيص الأمراض الوراثية والالتهابات والأمراض الفيروسية في أي مرحلة (حادة أو مزمنة)، وكذلك - في مرحلة مبكرة - قبل المظاهر الواضحة للمرض عن طريق تحديد مسببات الأمراض على أساس الحمض النووي، الحمض النووي الريبي (RNA)، وهي مادة وراثية، في العينات التي تم الحصول عليها من المريض. واليوم سنتحدث عن جوهر ومراحل التشخيص ومبادئ طرق تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، وكذلك تكلفتها.

ما هو تفاعل البوليميراز المتسلسل

أساس التحليل هو التضخيم (المضاعفة) – إنشاء العديد من النسخ من مقطع قصير من الحمض النووي (الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين)، الذي يمثل المجمع الجيني البشري. تتطلب الدراسة كمية صغيرة جدًا من المادة الفسيولوجية (البلغم، البراز، القشط الظهاري، عصير البروستاتا، الدم، الحيوانات المنوية، السائل الأمنيوسي، المخاط، أنسجة المشيمة، البول، اللعاب، السائل الجنبي، السائل النخاعي). في هذه الحالة، على سبيل المثال، يمكن اكتشاف حتى ميكروب ضار واحد في الجهاز البولي التناسلي للمريض.

تم تطوير تقنية PCR (تفاعل البوليميراز المتسلسل) من قبل العالم الأمريكي ك. موليس، الذي حصل على جائزة نوبل في عام 1993.

تستخدم بنشاط:

• في التشخيص المبكر للإصابات الوراثية؛
• في الفحص الطبي الشرعي عندما تكون هناك كمية صغيرة للغاية من الحمض النووي متاحة للفحص؛
• في الطب البيطري، والمستحضرات الصيدلانية، وعلم الأحياء، وعلم الوراثة الجزيئية؛
• لتحديد هوية الشخص عن طريق الحمض النووي، وتأكيد الأبوة؛
• في علم الحفريات والأنثروبولوجيا والبيئة (عند مراقبة جودة المنتجات والعوامل البيئية).

سيخبرك هذا الفيديو بالتفصيل عن تفاعل البوليميراز المتسلسل:

لمن يوصف؟

يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل في تشخيص الأمراض المعدية أحد أكثر الطرق الموثوقة ذات الدقة والموثوقية الخاصة. على سبيل المثال، موثوقية تحليل PCR للكلاميديا ​​والعديد من مسببات الأمراض الأخرى تقترب من 100% (مطلقة). في أغلب الأحيان، يتم وصف إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل للمرضى الذين يجدون صعوبة في تحديد مسبب مرض معين أثناء التشخيص.

يستخدم اختبار PCR المختبري:

• للكشف عن مسببات الأمراض التي تسبب التهابات في الأعضاء البولية والتناسلية والتي يصعب تحديدها باستخدام الثقافة أو الطرق المناعية؛
• لإعادة تشخيص فيروس نقص المناعة البشرية في المرحلة الأولية في حالة وجود نتيجة إيجابية ولكن مشكوك فيها للاختبار الأولي (على سبيل المثال، عند الأطفال حديثي الولادة من آباء مصابين بالإيدز)؛
• تحديد السرطان في مرحلة مبكرة (دراسة طفرات الجينات المسرطنة) وضبط نظام العلاج بشكل فردي لمريض معين؛
• لغرض الكشف المبكر والعلاج المحتمل للأمراض الوراثية.

وبالتالي، يقوم الآباء في المستقبل بإجراء اختبار لمعرفة ما إذا كانوا حاملين لعلم الأمراض الوراثية، في الأطفال، يحدد PCR احتمال التعرض لمرض ينتقل عن طريق الميراث.

• للكشف عن أمراض الجنين في المراحل المبكرة من الحمل (يتم فحص الخلايا الفردية للجنين المتنامي بحثًا عن وجود طفرات محتملة) ؛
• في المرضى قبل زرع الأعضاء - "لكتابة الأنسجة" (تحديد توافق الأنسجة)؛
• تحديد الكائنات المسببة للأمراض الخطيرة في دم المتبرع؛
• في الأطفال حديثي الولادة - لتحديد الالتهابات الخفية.
• لتقييم نتائج العلاج المضاد للفيروسات والمضادات للميكروبات.

لماذا الخضوع لمثل هذا الإجراء؟

نظرًا لأن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو وسيلة تشخيصية فعالة للغاية، حيث يعطي نتائج بنسبة 100% تقريبًا، يتم استخدام الإجراء:

• لتأكيد أو استبعاد التشخيص النهائي.
• التقييم السريع لفعالية العلاج.

في كثير من الحالات، يكون تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو الاختبار الوحيد الممكن للكشف عن المرض النامي إذا كانت طرق التشخيص البكتريولوجية والمناعية والفيروسية الأخرى غير مجدية.

• يتم الكشف عن الفيروسات باستخدام إجراء PCR مباشرة بعد الإصابة وقبل ظهور علامات المرض. الاكتشاف المبكر للفيروس يسمح بالعلاج الفوري.
• يتم أيضًا تحديد ما يسمى بـ "الحمل الفيروسي" (أو عدد الفيروسات في الجسم) عن طريق تحليل الحمض النووي باستخدام طريقة كمية.
• مسببات الأمراض المحددة (على سبيل المثال، عصية السل كوخ) صعبة وتستغرق وقتا طويلا للثقافة. يسمح اختبار PCR بالكشف السريع عن الحد الأدنى من مسببات الأمراض (الحية والميتة) في عينات مناسبة للاختبار.

يتم استخدام تحليل الحمض النووي الممرض التفصيلي:

• لتحديد حساسيته لأنواع معينة من المضادات الحيوية، مما يسمح بالعلاج الفوري؛
• ومكافحة انتشار الأوبئة بين الحيوانات الأليفة والبرية؛
• لتحديد وتتبع الأنواع الميكروبية المعدية الجديدة والأنواع الفرعية من مسببات الأمراض التي غذت الأوبئة السابقة.

أنواع التشخيص

الطريقة القياسية

يتم إجراء تحليل تفاعل البلمرة المتسلسل على أساس التضخيم المتعدد (المضاعفة) لجزء معين من الحمض النووي الريبي (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام إنزيمات تمهيدية خاصة. ونتيجة لسلسلة النسخ، يتم الحصول على كمية كافية من المواد للبحث.

أثناء الإجراء، يتم نسخ الجزء المطلوب فقط (المطابق للشروط المحددة المحددة) وما إذا كان موجودًا بالفعل في العينة.

يشرح هذا الفيديو التفصيلي مع الرسوم البيانية المفيدة كيفية عمل تفاعل البوليميراز المتسلسل:

أساليب أخرى

• في الوقت الحقيقي PCR. في هذا النوع من الأبحاث، تبدأ عملية تحديد جزء معين من الحمض النووي بعد كل دورة، وليس بعد إكمال السلسلة الكاملة المكونة من 30 إلى 40 دورة. يتيح لك هذا النوع من الأبحاث الحصول على معلومات حول كمية العامل الممرض (الفيروس أو الميكروب) في الجسم، أي إجراء تحليل كمي.
• RT-PCR (وضع النسخ العكسي). يُستخدم هذا الاختبار للبحث عن الحمض النووي الريبوزي (RNA) المفرد الذي تقطعت به السبل للكشف عن الفيروسات التي قاعدتها الجينية هي الحمض النووي الريبي (على سبيل المثال، فيروس التهاب الكبد الوبائي سي، وفيروس نقص المناعة البشرية). في هذه الدراسة، يتم استخدام إنزيم خاص - النسخ العكسي وتمهيد محدد، ويتم بناء الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل على أساس الحمض النووي الريبي (RNA). ثم يتم استعادة شريط الحمض النووي الثاني من هذا الشريط ويتم تنفيذ الإجراء القياسي.

مؤشرات للاختبار

يتم استخدام إجراء PCR في عيادة الأمراض المعدية وحديثي الولادة والتوليد وطب الأطفال والمسالك البولية وأمراض النساء والأمراض التناسلية وأمراض الأعصاب وأمراض الكلى وطب العيون.

مؤشرات للاختبار:

• تحديد خطر الإصابة بالتشوهات الوراثية لدى الطفل مع احتمالية الإصابة بأمراض وراثية؛
• تشخيص كلا الوالدين عند التخطيط للحمل أو تشخيص الحالة الخطيرة للأم أثناء الحمل المستمر؛
• صعوبات في الحمل وتحديد أسباب العقم.
• الاشتباه في الإصابة بالأمراض المنقولة جنسياً في المرحلة الحادة وأعراض انتقالها إلى الحالة المزمنة.
• الكشف عن أسباب العمليات الالتهابية من أصل غير معروف.
• الاتصالات الجنسية العرضية والمنتظمة غير المحمية؛
• تحديد حساسية الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض لمضادات حيوية معينة؛
• المرضى الذين يشتبه في إصابتهم بعدوى كامنة للكشف عن مسببات الأمراض قبل ظهور الأعراض الواضحة (التشخيص قبل السريري)؛
• المرضى لتأكيد الشفاء بعد المرض (التشخيص بأثر رجعي)؛:

يتم استخدام التشخيص أيضًا إذا كان من الضروري تحديد مسببات الأمراض التالية بدقة::

• فيروسات التهاب الكبد (ABCG)، نقص المناعة البشرية، الفيروس المضخم للخلايا.
• ضمة الكوليرا؛
• فيروس الهربس البسيط، الأنواع الحلئية الشكل؛
• الرجعية - الغدة - والفيروسات الأنفية.
• فيروسات الحصبة الألمانية، وإبشتاين-بار، والحماق (النطاقي)؛
• البارفو والفيروسات البيكورنوفية؛
• بكتيريا هيليكوباكتر بيلوري.
• الليجيونيلا، الأنواع المسببة للأمراض من الإشريكية القولونية.
• المكورات العنقودية الذهبية؛
• العوامل الممرضة؛
• كلوستريديا، الخناق والمستدمية النزلية.

كما أنه يستخدم لتحديد الالتهابات:

• عدد كريات الدم البيضاء المعدية.
• داء البورليات، داء الليستريات، التهاب الدماغ الذي ينقله القراد.
• داء المبيضات الناجم عن فطريات المبيضات.
• الأمراض المنقولة جنسيا - داء المشعرات، داء الميورات، اللولبية الشاحبة، داء الغاردنريلات، السيلان، داء المفطورات، الكلاميديا.
• مرض الدرن.

موانع ل

نظرًا لأن الإجراء لا يتم تنفيذه مع المريض، دون أي تأثير على الجسم، ولكن باستخدام مادة بيولوجية مأخوذة للبحث، فلا توجد موانع لاستخدام PCR بسبب عدم وجود خطر محتمل.

ومع ذلك، لا يتم جمع المواد الحيوية من قناة عنق الرحم بعد إجراء التنظير المهبلي. يُسمح بتقديم المسحات والكشط للتحليل بعد 4-6 أيام فقط من نهاية الدورة الشهرية والتوقف التام عن الإفرازات.

هل الطريقة آمنة؟

من غير الممكن حدوث أي تأثير سلبي على المريض أثناء دراسة معزولة لمادته الحيوية في المختبر.

التحضير للإجراء (تقديم المواد البيولوجية للتحليل)

أي سوائل بيولوجية أو أنسجة أو إفرازات من الجسم تكون بمثابة عينة لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، الذي يكشف الحمض النووي لمسببات الأمراض الأجنبية. يتم أخذ مادة الاختبار على شكل أخذ دم من الوريد، أو كشط من الحنجرة، أو تجويف الأنف، أو مجرى البول، أو التجويف الجنبي، أو عنق الرحم.

قبل إجراء التشخيص، يشرح الطبيب للمريض ما هي المواد التي سيتم جمعها:

1. عند فحص الأمراض المنقولة جنسيا، يتم جمع إفرازات من الأعضاء التناسلية والبول ومسحة من مجرى البول.
2. عند تحليل الالتهابات الهربسية ، يتم أخذ الفيروس المضخم للخلايا وكثرة الوحيدات والبول ومسحة من الحلق لتحليلها ، ولالتهاب الكبد وداء المقوسات ، يتم أخذ الدم من الوريد.
3. من أجل تشخيص أنواع مختلفة، يتم جمع السائل النخاعي.
4. في أمراض الرئة، العينات التي يتم تحليلها هي البلغم والسائل الجنبي.
5. عند إجراء دراسة عن الالتهابات المحتملة داخل الرحم أثناء الحمل، يتم استخدام السائل الأمنيوسي وخلايا المشيمة للتحليل.

تعتمد موثوقية ودقة التحليل على عقم الظروف عند أخذ المادة. وبما أن اختبار PCR حساس للغاية، فإن أي تلوث لمادة الاختبار يمكن أن يشوه النتيجة.

التحضير الكفء لتسليم المواد الحيوية لا يمثل أي صعوبات للمرضى. هناك بعض التوصيات:

• عند تحليل الأمراض المنقولة جنسيا:
  • استبعاد الاتصالات الحميمة قبل 72 ساعة من تقديم المادة؛
  • التوقف عن استخدام أي منتجات مهبلية قبل 3 أيام؛
  • من مساء اليوم السابق، لا تنفذ النظافة في المنطقة التي يتم فحصها؛
  • استبعاد التبول لمدة 3-4 ساعات قبل أخذ عينة من مجرى البول؛
• التوقف عن تناول المضادات الحيوية قبل شهر من إجراء اختبار العدوى؛
• ويتم التبرع بالدم في الصباح قبل الأكل والشرب؛
• يتم جمع عينة البول في الصباح الأول في وعاء معقم بعد مرحاض حميم شامل.

اقرأ أدناه حول كيفية إجراء التشخيص باستخدام طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل.

كيف يعمل هذا الإجراء؟

عند إجراء دراسة PCR، يتم تكرار دورات معينة مرارًا وتكرارًا في المفاعل (مضخم أو جهاز تدوير حراري):

1. الخطوة الأولى هي تمسخ الطبيعة. يتم وضع اللعاب والدم ومواد الخزعة وعينات أمراض النساء والبلغم، التي يشتبه في وجود الحمض النووي (أو الحمض النووي الريبي) لمسببات الأمراض، في مكبر للصوت، حيث يتم تسخين المادة وتقسيم الحمض النووي إلى سلسلتين منفصلتين.
2. الخطوة الثانية هي التلدين أو التبريد الطفيف للمادةوإضافة البادئات إليها التي يمكنها التعرف على المناطق المرغوبة في جزيء الحمض النووي والارتباط بها.
3. الخطوة الثالثة هي الاستطالة- يحدث بعد ربط بادئين بكل شريط من سلاسل الحمض النووي. خلال هذه العملية، يتم الانتهاء من جزء الحمض النووي للعامل الممرض، ويتم تشكيل نسخته.

وتتكرر هذه الدورات مثل "التفاعل المتسلسل"، مما يؤدي في كل مرة إلى مضاعفة نسخ جزء معين من الحمض النووي (على سبيل المثال، الجزء الذي تتم فيه برمجة فيروس معين). وفي غضون ساعات قليلة، يتم تكوين العديد من النسخ من جزء الحمض النووي، ويتم الكشف عن وجودها في العينة. بعد ذلك، يتم تحليل النتائج ومقارنتها بالبيانات من قاعدة بيانات لأنواع مختلفة من مسببات الأمراض لتحديد نوع العدوى.

اقرأ أدناه حول فك تشفير النتائج والاستنتاج بناءً على تفاعل PCR.

فك تشفير النتائج

يتم إصدار النتيجة النهائية للدراسة بعد يوم أو يومين من تقديم المادة البيولوجية. في كثير من الأحيان - بالفعل في اليوم الأول بعد التحليل.

التحليل النوعي

• سلبيوتعني النتيجة عدم العثور على أي آثار للعوامل المعدية في المادة المقدمة للاختبار.
• إيجابيوتعني النتيجة اكتشاف الفيروسات أو البكتيريا المسببة للأمراض في العينة البيولوجية بدرجة عالية جدًا من الدقة وقت تقديم المادة.

إذا كانت النتيجة إيجابية، ولكن لم يتم الكشف عن أي علامات لزيادة العدوى، فإن هذه الحالة من الجسم تسمى "النقل الصحي" بدون أعراض. غالبًا ما يتم ملاحظته عند تناول مادة حيوية من مكان معين (قناة عنق الرحم، مجرى البول، تجويف الفم) في الأمراض الفيروسية. في هذه الحالة لا يلزم العلاج، بل يلزم الإشراف الطبي المستمر، حيث أن هناك احتمال:

• انتشار الفيروس من حامليه وإصابة الأشخاص الأصحاء؛
• تفعيل العملية وانتقال المرض إلى شكل مزمن.

ومع ذلك، إذا كان اختبار الدم إيجابيا، فهذا يشير إلى أن العدوى قد ضربت الجسم، ولم تعد هذه حالة ناقلة، ولكنها علم الأمراض الذي يتطلب علاجا محددا فوريا.

تحليل كمي

يتم تحديد النتيجة الكمية من قبل متخصص خصيصًا لنوع معين من العدوى. وبناء على ذلك، من الممكن تقييم درجة تطور ومرحلة المرض، مما يجعل من الممكن وصف العلاج الصحيح على الفور.

متوسط ​​السعر

يتم تحديد أسعار تفاعل البوليميراز المتسلسل حسب: نوع البحث، وصعوبة تحديد العامل الممرض، وصعوبة جمع المادة البيولوجية، ونوع التحليل (نوعي أو كمي)، ومستوى السعر في المختبر.

من ناحية أخرى، عند دراسة PCR، من الممكن تحديد العديد من مسببات الأمراض في وقت واحد عند جمع نوع واحد من المواد للتحليل. هذا يسمح لك بالتوفير في الاختبارات المعملية الأخرى.

التكلفة التقريبية لتحليل PCR بالروبل:

• المكورات البنية، الغاردنريلة، المشعرة المهبلية - من 180
• الكلاميديا ​​الحثرية - من 190
• فيروس الورم الحليمي – من 380 إلى 500
• التكاثر الحيوي للجهاز البولي التناسلي لدى النساء (التقييم الكمي والنوعي للنباتات الدقيقة) – من 800.

المزيد من المعلومات المفيدة بخصوص اختبار PCR موجودة في الفيديو أدناه:

مبدأ الطريقة (الأساس البيولوجي الجزيئي)

من بين مجموعة واسعة من طرق التهجين لتحليل الحمض النووي، يتم استخدام طريقة PCR على نطاق واسع في التشخيص المختبري السريري.

مبدأ الطريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)تم تطوير (تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)) بواسطة كاري موليس (Cetus، الولايات المتحدة الأمريكية) في عام 1983. ويستخدم حاليًا على نطاق واسع للبحث العلمي والتشخيص في مجال الرعاية الصحية العملية وخدمة المراقبة الصحية والوبائية الحكومية (التنميط الجيني وتشخيص الأمراض المعدية).

تعتمد طريقة PCR على عملية طبيعية - إكمال تكميلي لمصفوفة الحمض النووي، ويتم تنفيذها باستخدام إنزيم بوليميريز الحمض النووي. ويسمى رد الفعل هذا تكرار الحمض النووي.

يتضمن تكرار الحمض النووي الطبيعي عدة مراحل:

1) تمسخ الحمض النووي(تفكيك الحلزون المزدوج، وتباعد خيوط الحمض النووي)؛

2) تكوين مقاطع قصيرة من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل(الاشعال اللازمة لبدء تخليق الحمض النووي)؛

3) توليف شريط DNA جديد(إكمال تكميلي للموضوعين)

يمكن استخدام هذه العملية للحصول على نسخ مقاطع قصيرة من الحمض النووي الخاص بكائنات دقيقة معينة،أولئك. إجراء بحث مستهدف لمثل هذه المجالات المحددة، وهو هدف التشخيص الجيني لتحديد مسببات الأمراض المعدية.

اكتشاف بوليميريز الحمض النووي القابل للحرارة (بوليميريز طق) من البكتيريا المحبة للحرارة ثيرميس المائي، والتي تكون درجة الحرارة المثلى لها في حدود 70-72 درجة مئوية، جعلت من الممكن جعل عملية تكرار الحمض النووي دورية واستخدامها للعمل في المختبر. إن إنشاء منظمات الحرارة القابلة للبرمجة (مكبرات الصوت)، والتي تنفذ تغيرات دورية في درجات الحرارة وفقًا لبرنامج معين، قد خلق المتطلبات الأساسية لإدخال طريقة PCR على نطاق واسع في ممارسة التشخيص السريري المختبري. مع التكرار المتعدد لدورات التوليف، تحدث زيادة هائلة في عدد نسخ جزء محدد من الحمض النووي، مما يجعل من الممكن الحصول على عدد كافٍ من نسخ الحمض النووي من كمية صغيرة من المادة التي تم تحليلها، والتي قد تحتوي على خلايا كائن حي دقيق واحد، التعرف عليهم عن طريق الكهربائي.

لا يبدأ إكمال السلسلة التكميلية عند أي نقطة في تسلسل الحمض النووي، ولكن فقط في كتل بداية معينة - مقاطع قصيرة مزدوجة الجديلة. من خلال ربط هذه الكتل بأجزاء معينة من الحمض النووي، من الممكن توجيه عملية تصنيع سلسلة جديدة فقط في هذا القسم، وليس على طول سلسلة الحمض النووي بالكامل. لإنشاء كتل بداية في أقسام معينة من الحمض النووي، يُطلق على اثنين من بادئات قليل النوكليوتيد (20 زوجًا من النيوكليوتيدات) الاشعال.تعتبر البادئات مكملة لتسلسلات الحمض النووي على الحدود اليسرى واليمنى لجزء معين ويتم توجيهها بطريقة بحيث يتم إكمال سلسلة الحمض النووي الجديدة بينهما فقط.

وبالتالي، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل عبارة عن زيادة متعددة في عدد النسخ (التضخيم) لمنطقة محددة من الحمض النووي يتم تحفيزها بواسطة إنزيم بوليميراز الحمض النووي.

لتنفيذ التضخيم، المكونات التالية مطلوبة:

خليط من ثلاثي فوسفات ديوكسينوكليوتيد (dNTPs)(خليط من أربعة dNTPs، وهي المادة اللازمة لتخليق سلاسل الحمض النووي التكميلية الجديدة)

إنزيم بوليميريز طق(بوليميراز الحمض النووي القابل للحرارة الذي يحفز استطالة السلاسل التمهيدية عن طريق إضافة قواعد النيوكليوتيدات بشكل تسلسلي إلى السلسلة المتنامية من الحمض النووي المركب).

محلول منظم(وسط تفاعل يحتوي على أيونات Mg2+ الضرورية للحفاظ على نشاط الإنزيم)
لتحديد مناطق محددة من جينوم فيروسات الحمض النووي الريبوزي (RNA)، يتم الحصول أولاً على نسخة الحمض النووي (DNA) من قالب الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام تفاعل النسخ العكسي (RT) المحفز بواسطة إنزيم الراجع (النسخ العكسي).

للحصول على عدد كاف من النسخ من قطعة الحمض النووي المميزة المطلوبة، يشمل التضخيم عدة (20-40) دورة.

تتضمن كل دورة تضخيم 3 مراحل تحدث في ظروف درجات حرارة مختلفة المرحلة 1: تمسخ الحمض النووي(فك ضفيرة الحلزون المزدوج). يحدث عند 93-95 درجة مئوية لمدة 30-40 ثانية. المرحلة 2: ربط الاشعال (التليين).يحدث ربط البادئات بشكل مكمل للتسلسلات المقابلة على خيوط الحمض النووي المتقابلة عند حدود منطقة معينة. كل زوج من البادئات له درجة حرارة التلدين الخاصة به، والتي تتراوح قيمها بين 50-65 درجة مئوية. وقت التلدين -20-60 ثانية. المرحلة 3: الانتهاء من سلاسل الحمض النووي.تتم الإضافة التكميلية لخيوط الحمض النووي من النهاية 5' إلى النهاية 3' من السلسلة في اتجاهين متعاكسين، بدءًا من مواقع الارتباط الأولية. المادة اللازمة لتخليق سلاسل الحمض النووي الجديدة هي ثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونوكليوتيد (dNTPs) المضاف إلى المحلول. يتم تحفيز عملية التوليف بواسطة إنزيم بوليميريز الحمض النووي القابل للحرارة (بوليميراز طق) وتتم عند درجة حرارة 70-72 درجة مئوية. وقت التوليف هو 20-40 ثانية.

تعمل سلاسل الحمض النووي الجديدة التي تشكلت في دورة التضخيم الأولى كقوالب لدورة التضخيم الثانية، حيث يتم تشكيل جزء الحمض النووي المحدد المطلوب (الأمبليكون). (انظر الشكل 2). في دورات التضخيم اللاحقة، تعمل الأمبليكونات كقالب لتركيب سلاسل جديدة. وبالتالي، تتراكم الأمبليكونات في المحلول وفقًا للصيغة 2n، حيث n هو عدد دورات التضخيم. لذلك، حتى لو كان الحل الأولي يحتوي في البداية على جزيء DNA مزدوج الجديلة واحد فقط، ففي 30-40 دورة، يتراكم حوالي 108 جزيئات أمبليكون في المحلول. هذا المبلغ يكفي للكشف البصري الموثوق به لهذه القطعة عن طريق التفريد الكهربائي لهلام الاغاروز. يتم تنفيذ عملية التضخيم في منظم حرارة خاص قابل للبرمجة (مكبر للصوت)، والذي، وفقًا لبرنامج معين، يغير درجات الحرارة تلقائيًا وفقًا لعدد دورات التضخيم.

مراحل تحليل PCR

تعتمد طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل، كأداة للتشخيص المختبري للأمراض المعدية، على اكتشاف جزء صغير من الحمض النووي للعامل الممرض (عدة مئات من الأزواج الأساسية)، وهي محددة فقط لكائن حي دقيق معين، وذلك باستخدام تفاعل سلسلة البوليميراز لتجميع المطلوب شظية.
يتضمن إجراء التحليل باستخدام طريقة PCR ثلاث مراحل:

1. عزل الحمض النووي (RNA) من العينة السريرية

2. تضخيم أجزاء محددة من الحمض النووي
3. الكشف عن منتجات التضخيم

عزل الحمض النووي (RNA).
في هذه المرحلة من التحليل تخضع العينة السريرية لمعاملة خاصة، ينتج عنها تحلل المادة الخلوية، وإزالة أجزاء البروتين والسكريات، والحصول على محلول DNA أو RNA خالي من
مثبطات وجاهزة لمزيد من التضخيم.
يتم تحديد اختيار تقنية عزل الحمض النووي (RNA) بشكل أساسي حسب طبيعة المادة السريرية التي تتم معالجتها.

تضخيم شظايا محددة من الحمض النووي
في هذه المرحلة، تتراكم أجزاء الحمض النووي القصيرة المحددة بالكمية اللازمة لمزيد من الكشف عنها. تستخدم معظم طرق تحديد أجزاء معينة من الجينوم ما يسمى ب. "نسخة كلاسيكية من PCR المستهدف. لزيادة خصوصية وحساسية التحليل، تستخدم بعض الطرق طريقة PCR "المتداخلة"، والتي تستخدم زوجين من البادئات ("الخارجية" - للمرحلة 1، و"الداخلية" - للمرحلة 2).

الكشف عن منتجات التضخيم
في معظم الطرق، في هذه المرحلة، يتم فصل خليط منتجات التضخيم التي تم الحصول عليها في المرحلة الثانية عن طريق الرحلان الكهربائي الأفقي في هلام الاغاروز. قبل الفصل الكهربي، يضاف محلول بروميد الإيثيديوم إلى خليط التضخيم، والذي يشكل مركبات خلالية قوية مع شظايا الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل. هذه المركبات قادرة على التألق تحت الأشعة فوق البنفسجية، والتي يتم تسجيلها على شكل أشرطة مضيئة برتقالية حمراء بعد الفصل الكهربي لخليط التضخيم في هلام الاغاروز.

كبديل لطريقة الكشف الكهربي، والتي لها بعض العيوب: الذاتية في قراءة النتائج، والقيود على تحديد الحمض النووي للكائنات الحية الدقيقة المختلفة في تفاعل واحد، يمكن اقتراحها مخططات الكشف عن التهجين.في هذه المخططات، يتم تهجين جزء الحمض النووي الناتج عن التضخيم (يشكل مجمعات ثنائية الجديلة - "الهجينة") مع مسبار قليل النوكليوتيد محدد. يمكن إجراء تسجيل هذه المجمعات بطريقة قياس الألوان أو قياس الفلور. قام SPF "Litekh" بإنشاء مجموعات كشف تعتمد على التهجين مع تسجيل النتائج الفلورية

مزايا طريقة PCR كوسيلة لتشخيص الأمراض المعدية:

- التحديد المباشر لوجود مسببات الأمراض

العديد من طرق التشخيص التقليدية، مثل المقايسة المناعية الإنزيمية، تحدد البروتينات الواسمة التي هي مخلفات العوامل المعدية، والتي توفر فقط دليلاً غير مباشر على وجود العدوى. إن تحديد جزء معين من الحمض النووي الممرض بواسطة PCR يعطي إشارة مباشرة إلى وجود العامل المعدي.

- خصوصية عالية
ترجع الخصوصية العالية لطريقة PCR إلى حقيقة أنه تم اكتشاف جزء فريد من الحمض النووي، مميز فقط لمسبب مرض معين، في المادة قيد الدراسة. يتم تحديد الخصوصية من خلال تسلسل النيوكليوتيدات من الاشعال، الذي يلغي
إمكانية الحصول على نتائج خاطئة، على عكس طريقة المقايسة المناعية الإنزيمية، حيث تشيع الأخطاء بسبب المستضدات المتفاعلة.

- حساسية عالية
تسمح لك طريقة PCR باكتشاف الخلايا المفردة من البكتيريا أو الفيروسات. يكتشف تشخيص PCR وجود مسببات الأمراض للأمراض المعدية في الحالات التي تكون فيها الطرق الأخرى (المناعية والبكتريولوجية،
المجهري) وهذا لا يمكن القيام به. حساسية تحليل PCR هي 10-1000 خلية لكل عينة (حساسية الاختبارات المناعية والمجهرية هي 103-105 خلية).

-جامعة إجراءات تحديد مسببات الأمراض المختلفة
المادة المستخدمة للبحث باستخدام طريقة PCR هي الحمض النووي للعامل الممرض. تعتمد الطريقة على تحديد جزء من DNA أو RNA خاص بكائن حي معين. إن تشابه التركيب الكيميائي لجميع الأحماض النووية يسمح باستخدام طرق موحدة لإجراء البحوث المختبرية. وهذا يجعل من الممكن تشخيص العديد من مسببات الأمراض من عينة حيوية واحدة. يمكن استخدام الإفرازات البيولوجية المختلفة (المخاط والبول والبلغم) وكشط الخلايا الظهارية والدم والمصل كمواد اختبار.

- سرعة عالية في الحصول على نتائج التحليل
لا يتطلب تحليل PCR عزل وزراعة ثقافة العامل الممرض، الأمر الذي يستغرق الكثير من الوقت. تتيح الطريقة الموحدة لمعالجة المواد الحيوية واكتشاف منتجات التفاعل وأتمتة عملية التضخيم إجراء تحليل كامل خلال 4-4.5 ساعات.

تجدر الإشارة إلى أن طريقة PCR يمكنها اكتشاف مسببات الأمراض ليس فقط في المواد السريرية التي يتم الحصول عليها من المريض، ولكن أيضًا في المواد التي يتم الحصول عليها من الكائنات البيئية (المياه والتربة وما إلى ذلك)

تطبيق طريقة PCR في الرعاية الصحية العملية

إن استخدام طريقة PCR لتشخيص الأمراض المعدية ذات الطبيعة البكتيرية والفيروسية له أهمية كبيرة في حل العديد من مشاكل علم الأحياء الدقيقة وعلم الأوبئة. يساهم استخدام هذه الطريقة أيضًا في تطوير الأبحاث الأساسية في مجال دراسة الأمراض المعدية المزمنة وغير المفهومة جيدًا.

الاستخدام الأكثر فعالية ومجديًا اقتصاديًا لهذه الطريقة هو:

ممارسة أمراض الجهاز البولي التناسلي- للكشف عن الكلاميديا، ureaplasmosis، السيلان، الهربس، داء الغاردنريلات، عدوى الميكوبلازما.

في أمراض الرئة- للتشخيص التفريقي للالتهاب الرئوي الفيروسي والبكتيري والسل.

في أمراض الجهاز الهضمي- لتحديد بكتيريا الملوية.

في عيادة الأمراض المعدية- كوسيلة سريعة لتشخيص داء السلمونيلا، والدفتيريا، والتهاب الكبد الفيروسي B، C وG؛

في أمراض الدم- للكشف عن عدوى الفيروس المضخم للخلايا والفيروسات الورمية.

1. تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

2. مبدأ طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل

2.1 وجود عدد من المكونات في خليط التفاعل

2.2 نظام درجة الحرارة الدورية

2.3 المبادئ الأساسية لاختيار الاشعال

2.4 تأثير الهضبة

3. مراحل تفاعل البوليميراز المتسلسل

3.2 التضخيم

3.4.1 الضوابط الإيجابية

3.4.2 الضوابط الداخلية

4.1 التحليل النوعي

4.1.2 الكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبي (RNA).

3.1 تحضير العينة البيولوجية

لعزل الحمض النووي، يتم استخدام تقنيات مختلفة اعتمادًا على المهام المطروحة. يكمن جوهرها في استخلاص (استخراج) الحمض النووي من مستحضر بيولوجي وإزالة أو تحييد الشوائب الأجنبية للحصول على محضر DNA بنقاء مناسب لـ PCR.

تعتبر طريقة الحصول على تحضير الحمض النووي النقي الذي وصفه مارمور معيارًا وقد أصبحت كلاسيكية بالفعل. ويشمل التحلل البروتيني الأنزيمي يليه إزالة البروتين وتكرار الحمض النووي بالكحول. تسمح لك هذه الطريقة بالحصول على تحضير DNA نقي. ومع ذلك، فهي تتطلب عمالة كثيفة وتتضمن العمل مع مواد عدوانية وقوية الرائحة مثل الفينول والكلوروفورم.

إحدى الطرق الشائعة حاليًا هي طريقة استخراج الحمض النووي التي اقترحها Boom et al. تعتمد هذه الطريقة على استخدام عامل فوضوي قوي، جوانيدين ثيوسيانات (GuSCN)، لتحلل الخلايا وامتصاص الحمض النووي لاحقًا على حامل (خرز زجاجي، تراب دياتومي، حليب زجاجي، إلخ). بعد الغسيل، يبقى الحمض النووي في العينة، ويتم امتصاصه على الناقل، والذي يمكن إزالته منه بسهولة باستخدام محلول شطف. هذه الطريقة مريحة ومتقدمة تقنيًا ومناسبة لإعداد عينة للتضخيم. ومع ذلك، فإن فقدان الحمض النووي ممكن بسبب الامتصاص الذي لا رجعة فيه على الناقل، وكذلك أثناء عمليات الغسيل العديدة. وهذا مهم بشكل خاص عند العمل مع كميات صغيرة من الحمض النووي في العينة. بالإضافة إلى ذلك، حتى الكميات الضئيلة من GuSCN يمكن أن تمنع PCR. لذلك، عند استخدام هذه الطريقة، فإن الاختيار الصحيح للمواد الماصة والالتزام الدقيق بالفروق التكنولوجية أمر مهم للغاية.

وتعتمد مجموعة أخرى من طرق تحضير العينات على استخدام المبادلات الأيونية من نوع تشيليكس، والتي، على عكس الزجاج، لا تمتص الحمض النووي، بل الشوائب التي تتداخل مع التفاعل. كقاعدة عامة، تتضمن هذه التقنية مرحلتين: غليان العينة وامتصاص الشوائب في مبادل أيوني. هذه الطريقة جذابة للغاية بسبب بساطتها في التنفيذ. في معظم الحالات يكون مناسبًا للعمل مع المواد السريرية. لسوء الحظ، في بعض الأحيان توجد عينات بها شوائب لا يمكن إزالتها باستخدام المبادلات الأيونية. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن تدمير بعض الكائنات الحية الدقيقة عن طريق الغليان البسيط. وفي هذه الحالات، من الضروري إدخال مراحل إضافية لمعالجة العينات.

وبالتالي، ينبغي أن يؤخذ في الاعتبار اختيار طريقة تحضير العينة مع فهم أغراض التحليل المقصود.

3.2 التضخيم

لإجراء تفاعل التضخيم، من الضروري تحضير خليط التفاعل وإضافة عينة الحمض النووي التي تم تحليلها إليه. من المهم أن تأخذ في الاعتبار بعض ميزات التلدين التمهيدي. والحقيقة هي أنه، كقاعدة عامة، تحتوي العينة البيولوجية التي تم تحليلها على جزيئات مختلفة من الحمض النووي، والتي يكون للبادئات المستخدمة في التفاعل تماثل جزئي، وفي بعض الحالات مهم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تصلب البادئات مع بعضها البعض، وتشكل ديمرزات تمهيدية. كلاهما يؤدي إلى استهلاك كبير من الاشعال لتوليف منتجات التفاعل الثانوية (غير المحددة)، ونتيجة لذلك، يقلل بشكل كبير من حساسية النظام. وهذا يجعل من الصعب أو المستحيل قراءة نتائج التفاعل أثناء الرحلان الكهربائي.

3.3 تقييم نتائج التفاعل

لتقييم نتائج PCR بشكل صحيح، من المهم أن نفهم أن هذه الطريقة ليست كمية. من الناحية النظرية، يمكن اكتشاف منتجات التضخيم لجزيئات الحمض النووي المستهدفة باستخدام الرحلان الكهربائي بعد 30-35 دورة. ومع ذلك، من الناحية العملية، يتم ذلك فقط في الحالات التي يحدث فيها رد الفعل في ظل ظروف قريبة من المثالية، وهو ما لا يحدث غالبًا في الحياة. درجة نقاء إعداد الحمض النووي لها تأثير كبير بشكل خاص على كفاءة التضخيم، أي. وجود مثبطات معينة في خليط التفاعل، والتي قد يكون من الصعب للغاية التخلص منها في بعض الحالات. في بعض الأحيان، بسبب وجودها، حتى عشرات الآلاف من جزيئات الحمض النووي المستهدفة لا يمكن تضخيمها. وبالتالي، غالبًا لا توجد علاقة مباشرة بين الكمية الأولية من الحمض النووي المستهدف والكمية النهائية لمنتجات التضخيم.

3.3.1 طريقة الرحلان الكهربائي الأفقي

يتم استخدام طرق مختلفة لتصور نتائج التضخيم. الطريقة الأكثر شيوعًا اليوم هي الرحلان الكهربائي، استنادًا إلى فصل جزيئات الحمض النووي حسب الحجم. للقيام بذلك، قم بإعداد لوحة من هلام الاغاروز، الذي يتم ترسيخه بعد ذوبان الاغاروز في المخزن المؤقت الكهربائي بتركيز 1.5-2.5٪ مع إضافة صبغة الحمض النووي الخاصة، على سبيل المثال، بروميد الإيثيديوم. يشكل الاغاروز المتصلب شبكة مكانية. عند الصب باستخدام الأمشاط، يتم تشكيل آبار خاصة في الجل، والتي تضاف إليها فيما بعد منتجات التضخيم. يتم وضع لوحة الهلام في جهاز الرحلان الكهربي الأفقي ويتم توصيل مصدر جهد ثابت. يبدأ الحمض النووي المشحون سالبًا بالتحرك في الجل من ناقص إلى زائد. في هذه الحالة، تتحرك جزيئات الحمض النووي الأقصر بشكل أسرع من الجزيئات الأطول. تتأثر سرعة حركة الحمض النووي في الجل بتركيز الاغاروز، وقوة المجال الكهربائي، ودرجة الحرارة، وتكوين المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي، وبدرجة أقل، تكوين GC للحمض النووي. جميع الجزيئات ذات الحجم نفسه تتحرك بنفس السرعة. يتم دمج الصبغة (مقحم) بواسطة مجموعات مستوية في جزيئات الحمض النووي. بعد الانتهاء من الرحلان الكهربائي، الذي يستمر من 10 دقائق إلى ساعة واحدة، يتم وضع الجل على مرشح ناقل الإضاءة الذي ينبعث الضوء في نطاق الأشعة فوق البنفسجية (254 - 310 نانومتر). يتم نقل الطاقة فوق البنفسجية التي يمتصها الحمض النووي عند 260 نانومتر إلى الصبغة، مما يؤدي إلى تألقها في المنطقة البرتقالية الحمراء من الطيف المرئي (590 نانومتر).

قد يختلف سطوع نطاقات منتج التضخيم. ومع ذلك، لا يمكن أن يكون هذا مرتبطًا بالكمية الأولية من الحمض النووي المستهدف في العينة.

3.3.2 طريقة الرحلان الكهربائي العمودي

طريقة الرحلان الكهربائي العمودي تشبه بشكل أساسي طريقة الرحلان الكهربائي الأفقي. الفرق بينهما هو أنه في هذه الحالة يتم استخدام المواد الهلامية بولي أكريلاميد بدلا من الاغاروز. يتم تنفيذه في غرفة خاصة للرحلان الكهربائي العمودي. يتمتع الفصل الكهربائي للهلام متعدد الأكريلاميد بدقة أكبر مقارنة بالرحلان الكهربائي للاغاروز ويسمح للمرء بتمييز جزيئات الحمض النووي ذات الأحجام المختلفة بدقة نيوكليوتيد واحد. يعد تحضير هلام بولي أكريلاميد أكثر تعقيدًا إلى حد ما من هلام الاغاروز. بالإضافة إلى ذلك، تعتبر مادة الأكريلاميد مادة سامة. نظرًا لأن الحاجة إلى تحديد حجم منتج التضخيم بدقة 1 نيوكليوتيد نادرًا ما تنشأ، يتم استخدام طريقة الرحلان الكهربائي الأفقي في العمل الروتيني.

3.4 رصد التقدم المحرز في رد فعل التضخيم

3.4.1 الضوابط الإيجابية

يتم استخدام تحضير الحمض النووي للكائنات الحية الدقيقة المرغوبة كـ "تحكم إيجابي". تختلف الأمبليكونات غير النوعية في الحجم عن الأمبليكونات المتكونة نتيجة التضخيم باستخدام تحضير DNA للتحكم. قد تكون المنتجات غير المحددة أكبر أو أصغر حجمًا مقارنة بالتحكم الإيجابي. في أسوأ الحالات، قد تتطابق هذه الأحجام ويتم قراءتها على أنها إيجابية في الترحيل الكهربائي.

للتحكم في خصوصية منتج التضخيم الناتج، يمكنك استخدام مجسات التهجين (أقسام الحمض النووي الموجودة ضمن التسلسل المضخم)، الموسومة بعلامات الإنزيم أو النظائر المشعة والتفاعل مع الحمض النووي وفقًا لنفس مبادئ الاشعال. وهذا يعقد التحليل ويطيله بشكل كبير، وتزيد تكلفته بشكل كبير.

3.4.2 الضوابط الداخلية

ومن الضروري مراقبة تقدم التضخيم في كل أنبوب مع خليط التفاعل. ولهذا الغرض، يتم استخدام ما يسمى "الرقابة الداخلية". هو أي تحضير للحمض النووي يختلف عن الحمض النووي للكائن الحي الدقيق المطلوب. إذا تمت إضافة عنصر تحكم داخلي إلى خليط التفاعل، فسوف يصبح نفس الهدف للتليين التمهيدي مثل الحمض النووي الصبغي للعامل المعدي المطلوب. يتم تحديد حجم منتج تضخيم التحكم الداخلي بحيث يكون أكبر بمرتين أو أكثر من الأمبليكونات المتكونة من تضخيم الحمض النووي للكائنات الحية الدقيقة المطلوبة. ونتيجة لذلك، إذا تمت إضافة الحمض النووي للمراقبة الداخلية إلى خليط التفاعل مع عينة الاختبار، فبغض النظر عن وجود كائن حي دقيق في العينة البيولوجية، فإن المراقبة الداخلية ستتسبب في تكوين أمبليكونات محددة، ولكنها أطول بكثير (أثقل). من amplicon الكائنات الحية الدقيقة. إن وجود الأمبليكونات الثقيلة في خليط التفاعل سوف يشير إلى التقدم الطبيعي لتفاعل التضخيم وغياب المثبطات. إذا لم يتم تكوين أمبليكونات بالحجم المطلوب، ولكن أيضًا لم يتم تكوين أمبليكونات التحكم الداخلي، فيمكننا أن نستنتج أن هناك شوائب غير مرغوب فيها في العينة التي تم تحليلها ويجب التخلص منها، ولكن ليس حول غياب الحمض النووي المطلوب.

لسوء الحظ، على الرغم من كل جاذبية هذا النهج، إلا أنه يعاني من عيب كبير. إذا كان الحمض النووي المطلوب موجودا في خليط التفاعل، فإن كفاءة تضخيمه تنخفض بشكل حاد بسبب المنافسة مع الرقابة الداخلية على الاشعال. وهذا مهم بشكل خاص عند تركيزات الحمض النووي المنخفضة في عينة الاختبار، مما قد يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة.

ومع ذلك، بشرط أن يتم حل مشكلة المنافسة على الاشعال، فإن هذه الطريقة لرصد كفاءة التضخيم ستكون بالتأكيد مفيدة للغاية.

4. الطرق المعتمدة على تفاعل البوليميراز المتسلسل

4.1 التحليل النوعي

تم تطوير الطريقة الكلاسيكية لأداء PCR، والتي تم توضيح مبادئها أعلاه، في بعض التعديلات التي تهدف إلى التغلب على قيود PCR وزيادة كفاءة التفاعل.

4.1.1 طريقة إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام "البداية الساخنة"

للحد من خطر تكوين منتجات تفاعل تضخيم غير محددة، يتم استخدام نهج يسمى "البدء الساخن"، وجوهره هو منع إمكانية بدء التفاعل حتى يتم تحقيق الظروف في أنبوب الاختبار التي تضمن التلدين النوعي للتفاعل. الاشعال.

والحقيقة هي أنه، اعتمادًا على تكوين وحجم GC، فإن البادئات لها درجة حرارة انصهار معينة (Tm). إذا تجاوزت درجة حرارة النظام Tm، فإن التمهيدي يكون غير قادر على الالتزام بحبل الحمض النووي والتشوهات. مع مراعاة الظروف المثلى، أي. مع درجة حرارة التلدين قريبة من درجة حرارة الانصهار، يشكل التمهيدي جزيءًا مزدوجًا فقط إذا كان مكملاً تمامًا وبالتالي يضمن خصوصية التفاعل.

هناك خيارات مختلفة لتنفيذ "البداية الساخنة":

إضافة بوليميريز طق إلى خليط التفاعل خلال الدورة الأولى بعد تسخين الأنبوب إلى درجة حرارة التسخين.

يتم فصل مكونات خليط التفاعل بواسطة طبقة البارافين إلى طبقات (في الجزء السفلي - الاشعال، في الجزء العلوي - بوليميريز طق وأهداف الحمض النووي)، والتي يتم خلطها عند ذوبان البارافين (~ 65-75 درجة مئوية).

استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لبوليميراز طق. يصبح الإنزيم المرتبط بالأجسام المضادة وحيدة النسيلة نشطًا فقط بعد مرحلة تمسخ الطبيعة الأولى، عندما يتم تغيير طبيعة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة بشكل لا رجعة فيه وتحرر المواقع النشطة لبوليميراز طق.

في جميع الحالات المذكورة أعلاه، حتى لو حدث التلدين غير النوعي قبل بدء دورة درجة الحرارة، لا يحدث الاستطالة، وعند التسخين، يتم تغيير طبيعة مجمعات الحمض النووي التمهيدي، لذلك لا يتم تشكيل منتجات غير محددة. بعد ذلك، لا تنخفض درجة الحرارة في أنبوب الاختبار عن درجة حرارة الانصهار، مما يضمن تكوين منتج تضخيم محدد.

4.1.2 الكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبي (RNA).

إن إمكانية استخدام الحمض النووي الريبي (RNA) كهدف لـ PCR يوسع بشكل كبير نطاق تطبيقات هذه الطريقة. على سبيل المثال، يتم تمثيل جينومات العديد من الفيروسات (التهاب الكبد C، وفيروس الأنفلونزا، والفيروسات البيكورناوية، وما إلى ذلك) بواسطة الحمض النووي الريبي (RNA). علاوة على ذلك، في دورات حياتهم لا توجد مرحلة وسيطة من التحول إلى الحمض النووي. للكشف عن الحمض النووي الريبوزي (RNA)، يجب أولاً تحويله إلى شكل الحمض النووي (DNA). للقيام بذلك، يتم استخدام النسخ العكسي، الذي يتم عزله من فيروسين مختلفين: فيروس داء الأرومة النقوية الطيرية وفيروس سرطان الدم مولوني الفئران. يرتبط استخدام هذه الإنزيمات ببعض الصعوبات. بادئ ذي بدء، فهي قابلة للحرارة وبالتالي يمكن استخدامها في درجات حرارة لا تزيد عن 42 درجة مئوية. وبما أن جزيئات الحمض النووي الريبي (RNA) عند درجة الحرارة هذه تشكل بسهولة هياكل ثانوية، فإن كفاءة التفاعل تنخفض بشكل ملحوظ، ووفقًا لتقديرات مختلفة، تبلغ حوالي 5٪. تُبذل محاولات للتحايل على هذا العيب باستخدام بوليميريز قابل للحرارة تم الحصول عليه من الكائنات الحية الدقيقة المحبة للحرارة Thermus Thermophilus، والتي تظهر نشاط المنتسخة في وجود Mn 2+، كنسخة عكسية. إنه الإنزيم الوحيد المعروف القادر على إظهار نشاط البوليميراز والنسخ.

لتنفيذ تفاعل النسخ العكسي، يجب أن يحتوي خليط التفاعل، تمامًا كما هو الحال في PCR، على مواد أولية كتمهيد وخليط من 4 dNTPs كمواد بناء.

بعد إجراء تفاعل النسخ العكسي، يمكن أن تكون جزيئات [كدنا] الناتجة بمثابة هدف لـ PCR

5. تنظيم العملية التكنولوجية لأداء PCR

إن الحساسية العالية المحتملة لتفاعل البلمرة المتسلسل تجعل التصميم الدقيق لمختبر PCR ضروريًا للغاية. ويرجع ذلك إلى المشكلة الأكثر حدة في الطريقة - التلوث.

التلوث هو دخول جزيئات معينة من الحمض النووي من البيئة الخارجية إلى خليط التفاعل والتي يمكن أن تكون بمثابة أهداف في تفاعل التضخيم وتعطي نتائج إيجابية كاذبة.

هناك عدة طرق لمكافحة هذه الظاهرة غير السارة. أحدها هو استخدام إنزيم N-uracil glycosylase (UG). تعتمد هذه الطريقة على قدرة UG على تقطيع جزيئات الحمض النووي باستخدام اليوراسيل المضمن. يتم تنفيذ تفاعل التضخيم باستخدام خليط dNTP حيث يتم استبدال dTTP باليوراسيل، وبعد التدوير الحراري، ستحتوي جميع الأمبليكونات المتكونة في أنبوب الاختبار على اليوراسيل. إذا تمت إضافة CG إلى خليط التفاعل قبل التضخيم، فسيتم تدمير الأمبليكونات التي تدخل خليط التفاعل، في حين سيظل الحمض النووي الأصلي سليمًا وسيكون بمثابة هدف للتضخيم.

وبالتالي، فإن هذه الطريقة تقضي إلى حد ما فقط على مصدر التلوث ولا تضمن عدم الحصول على نتائج إيجابية كاذبة.

هناك طريقة أخرى لمكافحة نتائج التلوث وهي تقليل عدد دورات التفاعل بشكل كبير (حتى 25-30 دورة). ولكن حتى مع هذا النهج، فإن خطر الحصول على نتائج إيجابية كاذبة مرتفع، لأنه في هذه الحالة، في غياب مثبطات، من السهل الحصول على منتج تضخيم بسبب التلوث.

وبالتالي، وعلى الرغم من الفوائد المترتبة على تدابير التضخيم المسبق التي تهدف إلى تعطيل جزيئات الحمض النووي التي تسبب نتائج إيجابية كاذبة، فإن العلاج الأكثر تطرفا يتلخص في تنظيم مختبر مدروس جيدا.

خاتمة

تُستخدم طريقة PCR حاليًا على نطاق واسع كوسيلة لتشخيص الأمراض المعدية المختلفة. يسمح لك تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بتحديد مسببات العدوى حتى لو كانت العينة المأخوذة للتحليل تحتوي فقط على عدد قليل من جزيئات الحمض النووي للعامل الممرض. يستخدم PCR على نطاق واسع في التشخيص المبكر لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد الفيروسي وما إلى ذلك. اليوم لا يوجد تقريبًا أي عامل معدي لا يمكن اكتشافه باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل.

ومع ذلك، في ذلك الوقت ظلت هذه الفكرة لم يطالب بها أحد. تم إعادة اكتشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل في عام 1983 بواسطة كاري موليس. كان هدفه هو إنشاء طريقة تسمح بتضخيم الحمض النووي من خلال تكرارات متتالية متعددة لجزيء الحمض النووي الأصلي باستخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي. وبعد 7 سنوات من نشر هذه الفكرة، في عام 1993، حصل موليس على جائزة نوبل عنها.

في بداية استخدام الطريقة، بعد كل دورة تسخين وتبريد، كان لا بد من إضافة بوليميراز الحمض النووي إلى خليط التفاعل، حيث تم تعطيله بسرعة عند درجة الحرارة العالية المطلوبة لفصل خيوط حلزون الحمض النووي. كان الإجراء غير فعال للغاية وتطلب الكثير من الوقت والإنزيم. وفي عام 1986 تم تحسينه بشكل ملحوظ. لقد تم اقتراح استخدام بوليميرات الحمض النووي من البكتيريا المحبة للحرارة. وتبين أن هذه الإنزيمات قابلة للحرارة وكانت قادرة على تحمل العديد من دورات التفاعل. وقد أتاح استخدامها إمكانية تبسيط وأتمتة تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم عزل واحدة من أولى بوليميرات الحمض النووي القابلة للحرارة من البكتيريا ثيرموس المائيواسمه طق-بوليميراز. عيب هذا البوليميراز هو أن احتمال إدخال نيوكليوتيدات خاطئة مرتفع جدًا، نظرًا لأن هذا الإنزيم ليس لديه آليات تصحيح الخطأ (نشاط نوكلياز خارجي 3"←5"). البوليميرات بفوو بوو، المعزولة من العتائق، لديها مثل هذه الآلية؛ استخدامها يقلل بشكل كبير من عدد الطفرات في الحمض النووي، ولكن سرعة عملها (المعالجة) أقل من تلك الموجودة في طق. في الوقت الحاضر يتم استخدام الخلطات طقو بفولتحقيق سرعة بلمرة عالية ودقة نسخ عالية.

وفي وقت اختراع هذه الطريقة، كان موليس يعمل لدى شركة Cetus Corporation، التي حصلت على براءة اختراع لطريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل. في عام 1992، باعت شركة Cetus حقوق الطريقة وبراءة الاختراع المستخدمة طق- شركة بوليميراز هوفمان-لاروش (بالإنجليزية: Hoffmann-La Roche) مقابل 300 مليون دولار. ومع ذلك، اتضح ذلك طق-تم وصف البوليميراز من قبل عالم الكيمياء الحيوية الروسي أليكسي كالدين في عام 1980، وحاولت شركة بروميجا إجبار شركة روش على التنازل عن الحقوق الحصرية لهذا الإنزيم. انتهت صلاحية براءة الاختراع الأمريكية لطريقة PCR في مارس 2005.

إجراء PCR

تعتمد الطريقة على النسخ الانتقائي المتكرر لقسم معين من الحمض النووي باستخدام الإنزيمات تحت ظروف صناعية ( في المختبر). وفي هذه الحالة يتم نسخ القسم الذي يحقق الشروط المحددة فقط، وذلك في حالة وجوده في العينة محل الدراسة. على عكس تضخيم الحمض النووي في الكائنات الحية (النسخ المتماثل)، يتم تضخيم أجزاء قصيرة نسبيًا من الحمض النووي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل. في عملية PCR التقليدية، لا يزيد طول مقاطع الحمض النووي المنسوخ عن 3000 زوج قاعدي (3 كيلو بايت). باستخدام خليط من البوليميرات المختلفة، باستخدام المواد المضافة وتحت ظروف معينة، يمكن أن يصل طول جزء PCR إلى 20-40 ألف زوج من النيوكليوتيدات. وهذا لا يزال أقل بكثير من طول الحمض النووي الصبغي لخلية حقيقية النواة. على سبيل المثال، يتكون الجينوم البشري من حوالي 3 مليارات زوج قاعدي.

مكونات التفاعل

لإجراء PCR في أبسط الحالات، تكون المكونات التالية مطلوبة:

• مصفوفة الحمض النووي، يحتوي على جزء من الحمض النووي الذي يحتاج إلى تضخيم.
• اثنين من الاشعال، مكملاً للأطراف المقابلة لشرائط مختلفة من جزء الحمض النووي المطلوب.
• مستقرة حراريا بوليميريز الحمض النووي- إنزيم يحفز تفاعل بلمرة الحمض النووي. يجب أن يظل البوليميراز المستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل نشطًا عند درجات حرارة عالية لفترة طويلة، لذلك يتم استخدام الإنزيمات المعزولة من محبات الحرارة - ثيرموس المائي(طق بوليميريز)، بيروكوكوس فوريوسوس(بوليميريز بفو)، بيروكوكوس ووسي(بو بوليميريز) وغيرها.
• ديوكسينوكليوزيد ثلاثي الفوسفات(dATP، dGTP، dCTP، dTTP).
• أيونات Mg2+ الضرورية لعمل البوليميراز.
• محلول منظم، توفير ظروف التفاعل اللازمة - الرقم الهيدروجيني، والقوة الأيونية للحل. يحتوي على أملاح وألبومين المصل البقري.

لتجنب تبخر خليط التفاعل، قم بإضافة زيت عالي الغليان، مثل الفازلين، إلى أنبوب الاختبار. إذا كنت تستخدم جهاز تدوير حراري بغطاء ساخن، فهذا غير مطلوب.

يمكن أن تؤدي إضافة البيروفوسفاتيز إلى زيادة إنتاجية تفاعل PCR. يحفز هذا الإنزيم التحلل المائي للبيروفوسفات، وهو منتج ثانوي لإضافة نيوكليوتيد ثلاثي الفوسفات إلى شريط الحمض النووي المتنامي، إلى الأورثوفوسفات. قد يمنع البيروفوسفات تفاعل PCR.

الاشعال

تعتمد خصوصية PCR على تكوين مجمعات تكميلية بين القالب والبادئات، وهي أليغنوكليوتيدات اصطناعية قصيرة بطول 18-30 قاعدة. يعد كل كتاب تمهيدي مكملاً لأحد خيوط القالب المزدوج ويحد من بداية ونهاية المنطقة المضخمة.

بعد تهجين القالب مع التمهيدي (التليين)، يعمل الأخير بمثابة التمهيدي لبوليميراز الحمض النووي أثناء تخليق شريط القالب التكميلي (انظر).

أهم ما يميز الاشعال هو درجة حرارة الانصهار (Tm) لمجمع المصفوفة التمهيدية. T m هي درجة الحرارة التي يشكل عندها نصف قوالب الحمض النووي مركبًا مع بادئ قليل النوكليوتيد. يمكن تحديد درجة حرارة الانصهار تقريبًا بواسطة الصيغة حيث n X هو عدد النيوكليوتيدات X في التمهيدي. إذا تم تحديد الطول وتكوين النوكليوتيدات للبادئ أو درجة حرارة التلدين بشكل غير صحيح، فمن الممكن تكوين مجمعات مكملة جزئيًا مع مناطق أخرى من قالب الحمض النووي، مما قد يؤدي إلى ظهور منتجات غير محددة. الحد الأعلى لدرجة حرارة الانصهار محدود بدرجة الحرارة المثلى لعمل البوليميراز، الذي يتناقص نشاطه عند درجات حرارة أعلى من 80 درجة مئوية.

عند اختيار الاشعال، فمن المستحسن الالتزام بالمعايير التالية:

المضخم

أرز. 1: Cycler لPCR

يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في دورة حرارية - وهو جهاز يوفر التبريد والتدفئة الدورية لأنابيب الاختبار، بدقة لا تقل عن 0.1 درجة مئوية. تتيح لك أجهزة التدوير الحديثة ضبط برامج معقدة، بما في ذلك القدرة على "البدء السريع"، وTouchdown PCR (انظر أدناه) والتخزين اللاحق للجزيئات المضخمة عند 4 درجات مئوية. بالنسبة لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي، يتم إنتاج أجهزة مجهزة بكاشف الفلورسنت. هناك أيضًا أجهزة ذات غطاء أوتوماتيكي ومقصورة للألواح الدقيقة، مما يسمح بدمجها في الأنظمة الآلية.

تقدم رد الفعل

صورة هلامية تحتوي على علامة DNA (1) ومنتجات تفاعل PCR (2،3). توضح الأرقام طول شظايا الحمض النووي في أزواج النيوكليوتيدات

عادة، يتضمن تفاعل البوليميراز المتسلسل 20-35 دورة، تتكون كل منها من ثلاث مراحل (الشكل 2).

تمسخ

يتم تسخين قالب الحمض النووي المزدوج إلى 94-96 درجة مئوية (أو إلى 98 درجة مئوية إذا تم استخدام بوليميراز قابل للحرارة بشكل خاص) لمدة 0.5-2 دقيقة لفصل خيوط الحمض النووي. هذه المرحلة تسمى تمسخ، حيث يتم تدمير الروابط الهيدروجينية بين شريطي DNA. في بعض الأحيان، قبل الدورة الأولى (قبل إضافة البوليميراز)، يتم تسخين خليط التفاعل لمدة 2-5 دقائق. من أجل تمسخ القالب والاشعال بالكامل. هذه التقنية تسمى بداية ساخنة، فهو يسمح لك بتقليل كمية منتجات التفاعل غير المحددة.

التلدين

بمجرد انفصال الخيوط، يتم خفض درجة الحرارة للسماح للبادئات بالارتباط بالقالب المفرد الذي تقطعت به السبل. هذه المرحلة تسمى التلدين. تعتمد درجة حرارة التلدين على تركيبة البادئات وعادة ما يتم اختيارها عند درجة حرارة 4-5 درجة مئوية تحت درجة حرارة انصهارها. وقت المرحلة - 0.5-2 دقيقة. يؤدي الاختيار غير الصحيح لدرجة حرارة التلدين إما إلى ضعف ربط البادئات بالقالب (عند درجة حرارة عالية جدًا) أو الارتباط في المكان الخطأ وظهور منتجات غير محددة (عند درجة حرارة منخفضة جدًا).

استطالة

أنواع PCR

• يتم استخدام PCR "المتداخل" (Nested PCR) لتقليل عدد المنتجات الثانوية للتفاعل. يتم استخدام زوجين من البادئات ويتم تنفيذ تفاعلين متسلسلين. يقوم الزوج الثاني من البادئات بتضخيم منطقة من الحمض النووي داخل منتج التفاعل الأول.
• يتم استخدام PCR "المقلوب" (معكوس PCR) - في حالة معرفة منطقة صغيرة فقط ضمن التسلسل المطلوب. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص عندما يتعلق الأمر بتحديد التسلسلات المجاورة بعد إدخال الحمض النووي في الجينوم. لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المقلوب، يتم إجراء سلسلة من قطع الحمض النووي مع إنزيمات التقييد، يليها ربط الأجزاء (الربط). ونتيجة لذلك، ينتهي الأمر بالشظايا المعروفة عند طرفي المنطقة المجهولة، وبعد ذلك يمكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل كالمعتاد.
• يتم استخدام النسخ العكسي PCR (RT-PCR) لتضخيم أو عزل أو تحديد تسلسل معروف من مكتبة RNA. قبل PCR التقليدي، يتم تصنيع جزيء الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل على قالب mRNA باستخدام العكس ويتم الحصول على [كدنا] المفرد الذين تقطعت بهم السبل، والذي يستخدم كقالب لـ PCR. تحدد هذه الطريقة غالبًا مكان وزمان التعبير عن هذه الجينات.
• PCR غير المتماثل PCR غير المتماثل) - يتم إجراؤه عندما يكون من الضروري تضخيم أحد خيوط الحمض النووي الأصلي في الغالب. يستخدم في بعض تقنيات تحليل التسلسل والتهجين. يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) كالمعتاد، باستثناء أنه يتم أخذ أحد البادئات بكميات كبيرة.
• يتم استخدام PCR الكمي (Q-PCR) لقياس كمية DNA أو cDNA أو RNA المحددة في العينة بسرعة.
• تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي - تستخدم هذه الطريقة الكواشف ذات العلامات الفلورية لقياس كمية منتج التفاعل بدقة أثناء تراكمه.
• Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR) - باستخدام هذه الطريقة، يتم تقليل تأثير الارتباط غير المحدد للبادئات على تكوين المنتج. يتم تنفيذ الدورات الأولى عند درجة حرارة أعلى من درجة حرارة التلدين، ثم يتم خفض درجة الحرارة كل بضع دورات. عند درجة حرارة معينة، سيمر النظام عبر نطاق التحديد التمهيدي الأمثل للحمض النووي.
• طريقة المستعمرة الجزيئية (PCR في هلام، الإنجليزية. بولوني - مستعمرة PCR) - يتم بلمرة هلام الأكريلاميد بجميع مكونات PCR الموجودة على السطح ويتم إجراء PCR. في النقاط التي تحتوي على الحمض النووي الذي تم تحليله، يحدث التضخيم مع تكوين المستعمرات الجزيئية.
• PCR مع التضخيم السريع لل[كدنا] ينتهي التضخيم السريع لـ [كدنا] ينتهي، RACE-PCR )
• جزء طويل PCR PCR طويل المدى) - تعديل PCR لتضخيم المقاطع الممتدة من الحمض النووي (10 آلاف قاعدة أو أكثر). يتم استخدام اثنين من إنزيمات البوليميراز، أحدهما هو بوليميراز طق ذو عملية معالجة عالية (أي قادر على تصنيع سلسلة طويلة من الحمض النووي في مسار واحد)، والثاني هو بوليميراز الحمض النووي مع نشاط نوكلياز داخلي 3"-5". يعد البوليميراز الثاني ضروريًا لتصحيح الأخطاء التي أدخلها الأول.
• RAPD PCR التضخيم العشوائي للحمض النووي متعدد الأشكال PCR ، PCR مع التضخيم العشوائي للحمض النووي متعدد الأشكال - يستخدم عندما يكون من الضروري التمييز بين الكائنات الحية المتقاربة في التسلسل الجيني، على سبيل المثال، أنواع مختلفة من النباتات المزروعة أو سلالات الكلاب أو الكائنات الحية الدقيقة ذات الصلة الوثيقة. تستخدم هذه الطريقة عادة مادة تمهيدية صغيرة واحدة (20 - 25 نقطة أساس). سيكون هذا التمهيدي مكملاً جزئيًا للأجزاء العشوائية من الحمض النووي للكائنات الحية قيد الدراسة. ومن خلال تحديد الظروف (طول التمهيدي، وتكوينه، ودرجة الحرارة، وما إلى ذلك)، فمن الممكن تحقيق اختلاف مرضي في نمط PCR لكائنين.

إذا كان تسلسل النيوكليوتيدات في القالب معروفًا جزئيًا أو غير معروف على الإطلاق، فيمكنك استخدامه الاشعال المتدهورة، والذي يحتوي تسلسله على مواضع متدهورة يمكن تحديد موقع أي قواعد فيها. على سبيل المثال، يمكن أن يكون التسلسل التمهيدي: ...ATH...، حيث H هي A أو T أو C.

تطبيق PCR

يستخدم PCR في العديد من المجالات للاختبار والتجارب العلمية.

التحاليل الجنائية

يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لمقارنة ما يسمى بـ "البصمات الجينية". مطلوب عينة من المادة الوراثية من مسرح الجريمة - الدم، اللعاب، السائل المنوي، الشعر، إلخ. ويتم مقارنتها بالمادة الوراثية للمشتبه به. كمية صغيرة جدًا من الحمض النووي تكفي نظريًا، نسخة واحدة. يتم تقسيم الحمض النووي إلى أجزاء ثم يتم تضخيمه باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل. يتم فصل الأجزاء باستخدام الرحلان الكهربائي للحمض النووي. تسمى الصورة الناتجة لترتيب شرائط DNA البصمة الجينية(إنجليزي) البصمة الجينية).

إثبات الأبوة

أرز. 3: نتائج الرحلان الكهربي لشظايا الحمض النووي المضخم بواسطة PCR. (1) الأب. (2) الطفل. (3) الأم. يرث الطفل بعض سمات البصمة الجينية لكلا الوالدين، مما ينتج عنه بصمة جديدة وفريدة من نوعها.

على الرغم من أن البصمات الجينية فريدة من نوعها (باستثناء حالة التوائم المتطابقة)، إلا أنه لا يزال من الممكن إنشاء العلاقات الأسرية عن طريق عمل عدة بصمات أصابع (الشكل 3). ويمكن تطبيق نفس الطريقة، مع تعديل طفيف، لإثبات الارتباط التطوري بين الكائنات الحية.

التشخيص الطبي

يجعل PCR من الممكن تسريع وتسهيل تشخيص الأمراض الوراثية والفيروسية بشكل كبير. يتم تضخيم الجين محل الاهتمام بواسطة PCR باستخدام الاشعال المناسبة ومن ثم تسلسله لتحديد الطفرات. يمكن اكتشاف العدوى الفيروسية مباشرة بعد الإصابة، قبل أسابيع أو أشهر من ظهور الأعراض.

طب شخصي

ومن المعروف أن معظم الأدوية لا تؤثر على جميع المرضى الذين تستهدفهم، بل تؤثر فقط على 30-70% من عددهم. بالإضافة إلى ذلك، يتبين أن العديد من الأدوية سامة أو مسببة للحساسية بالنسبة لبعض المرضى. ترجع أسباب ذلك جزئيًا إلى الاختلافات الفردية في قابلية التأثر واستقلاب الأدوية ومشتقاتها. يتم تحديد هذه الاختلافات على المستوى الجيني. على سبيل المثال، في مريض واحد قد يكون السيتوكروم معين (بروتين الكبد المسؤول عن استقلاب المواد الغريبة) أكثر نشاطا، في مريض آخر - أقل. من أجل تحديد نوع السيتوكروم لدى مريض معين، يقترح إجراء تحليل PCR قبل استخدام الدواء. ويسمى هذا التحليل التنميط الجيني الأولي. التنميط الجيني المحتمل).

استنساخ الجينات

استنساخ الجينات (يجب عدم الخلط بينه وبين استنساخ الكائنات الحية) هو عملية عزل الجينات، ونتيجة لتلاعبات الهندسة الوراثية، الحصول على كمية كبيرة من منتج جين معين. يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم الجين، ثم يتم إدخاله فيه المتجه- جزء من الحمض النووي ينقل جينًا غريبًا إلى نفس الكائن أو إلى كائن آخر مناسب للزراعة. على سبيل المثال، يتم استخدام البلازميدات أو الحمض النووي الفيروسي كنواقل. عادة ما يتم استخدام إدخال الجينات في كائن غريب لإنتاج منتج ذلك الجين - RNA أو البروتين في أغلب الأحيان. وبهذه الطريقة يتم الحصول على العديد من البروتينات بكميات صناعية لاستخدامها في الزراعة والطب وغيرها.

أرز. 4: استنساخ الجينات باستخدام البلازميد. .
(1) الحمض النووي الصبغي للكائن أ. (2) PCR. (3) نسخ عديدة من جين الكائن أ. (4) إدخال الجين في البلازميد. (5) البلازميد مع جين الكائن أ. (6) إدخال البلازميد في الكائن الحي ب. (7) مضاعفة عدد نسخ جين الكائن أ في الكائن الحي ب.

تسلسل الحمض النووي

في طريقة التسلسل باستخدام الديديوكسينوكليوتيدات الموسومة بعلامة الفلورسنت أو النظائر المشعة، يعد PCR جزءًا لا يتجزأ، لأنه أثناء البلمرة يتم إدراج مشتقات النيوكليوتيدات الموسومة بعلامة الفلورسنت أو المشعة في سلسلة الحمض النووي. يؤدي هذا إلى إيقاف التفاعل، مما يسمح بتحديد مواقع نيوكليوتيدات معينة بعد فصل السلاسل المركبة في الجل.

الطفرات

حاليا، أصبح PCR الطريقة الرئيسية لتنفيذ الطفرات. لقد أتاح استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تبسيط وتسريع إجراء الطفرات، فضلاً عن جعله أكثر موثوقية وقابلية للتكرار.