Тканевая инженерия для стимулирования регенерации кости. Функциональная костная тканевая инженерия: импульсы и каркасные структуры. Современные возможности тканевой инженерии

Развитие современной клеточной трансплантологии и ее внедрение в клинику в последние десятилетия позволило продлить жизнь многим тысячам пациентов. В настоящее время наука о трансплантации клеток остается одной из самых интенсивно развивающихся областей биологии и медицины. Уже проходят клинические испытания такие методы, как:

– трансплантация собственных гемопоэтических клеток при рассеянном склерозе, системной красной волчанке, ревматоидном артрите;
– трансплантация гемопоэтических клеток при лечении злокачественных опухолей почек, молочной и поджелудочной желез, головного мозга;
– трансплантация донорских стволовых клеток для профилактики реакции «трансплантат против хозяина» после предшествующей трансплантации гемопоэтических клеток;
– адаптивная иммунотерапия (цитотоксические Т-лимфоциты) в онкологии, клеточные онковакцины;
– трансплантация миобластов скелетной мышечной ткани;
– трансплантация нейрональных клеток пациентам с постинсультным синдромом;
– трансплантация собственных и донорских клеток костного мозга для улучшения регенерации костной ткани после переломов.

Успехи в области изучения стволовых клеток во многом обусловлены повышенным интересом ученых и клиницистов к перспективам их использования в лечении заболеваний, в настоящее время считающихся неизлечимыми. Однако при этом возникает много этических вопросов (таких, например, как использование в качестве трансплантационного материала клеток эмбрионов человека), а также вопросов, связанных с правовой регуляцией клеточных технологий. В развитии клеточных технологий наиболее перспективными считаются следующие направления:

– выделение и трансплантация стволовых клеток, в том числе собственных клеток пациента;
– выявление субпопуляций и клонов стволовых клеток;
– тестирование безопасности трансплантации (инфекционной, онкогенной, мутагенной), составление «клеточного паспорта»;
– выделение индивидуальных линий эмбриональных стволовых клеток методом переноса ядра соматической клетки;
– коррекция генетических дефектов пренатальной трансплантацией клеток или комбинацией методов переноса ядра и генетической терапии.

Тканевая инженерия

Одним из направлений биотехнологии, которое занимается созданием биологических заместителей тканей и органов, является тканевая инженерия (ТИ).

Современная тканевая инженерия начала оформляться в самостоятельную дисциплину после работ Д.Р. Уолтера и Ф.Р. Мейера (1984), которым удалось восстановить поврежденную роговицу глаза с помощью пластического материала, искусственно выращенного из клеток, взятых у пациента. Этот метод получил название кератинопластика . После симпозиума, организованного Национальным научным фондом США (NSF) в 1987 г., тканевая инженерия стала считаться новым научным направлением в медицине. К настоящему времени большинство работ в этой области выполнено на лабораторных животных, но часть технологий уже используется в медицине.

Создания искусственных органов состоит из нескольких этапов (рис. 2).

Рис. 2. Схема процессинга тканеинженерных конструкций

На первом этапе отбирают собственный или донорский клеточный материал (биопсия), выделяют тканеспецифичные клетки и культивируют их. В состав тканеинженерной конструкции, или графта, кроме культуры клеток входит специальный носитель (матрица). Матрицы могут быть выполнены из различных биосовместимых материалов. Клетки полученной культуры наносятся на матрицу, после чего такая трехмерная структура переносится в биореактор1 с питательной средой, где инкубируется в течение определенного времени. Первые биореакторы были созданы для получения искусственной печеночной ткани.

Для каждого типа выращиваемого графта подбирают специальные условия культивирования. Например, для создания искусственных артерий используют проточный биореактор, в котором поддерживается постоянный проток питательной среды с переменным пульсовым давлением, имитирующим пульсацию тока крови.

Иногда при создании графта используют технологию префабрикации: конструкцию вначале помещают не на постоянное место, а в область, хорошо снабжаемую кровью, для дозревания и формирования микроциркуляции внутри графта.

В качестве клеточного материала для создания искусственных органов применяют культуры клеток, входящих в состав регенерируемой ткани или являющихся их предшественниками. Так, например, при получении графта для реконструкции фаланги пальца были использованы приемы, вызывающие направленную дифференцировку стволовых клеток костного мозга в клетки костной ткани.

Если для создания графта применялся собственный клеточный материала пациента, то происходит практически полная интеграция графта со скорейшим восстановлением функции регенерируемого органа. В случае использования графта с донорскими клетками в организме включаются механизмы индукции и стимуляции собственной репаративной активности, и за 1–3 месяца собственные клетки полностью замещают разрушающиеся клетки графта.

Биоматериалы, используемые для получения матриц, должны быть биологически инертными и после графтинга (перенесения в организм) обеспечивать локализацию нанесенного на них клеточного материала в определенном месте. Большинство биоматериалов тканевой инженерии легко разрушаются (резорбируются) в организме и замещаются его собственными тканями. При этом не должны образовываться промежуточные продукты, обладающие токсичностью, изменяющие рН ткани или ухудшающие рост и дифференцировку клеточной культуры. Нерезорбируемые материалы почти не применяются, т.к. они ограничивают регенерационную активность, вызывают избыточное образование соединительной ткани, провоцируют реакцию на инородное тело (инкапсуляцию).

Для создания тканей и органов применяются в основном синтетические материалы, материалы на основе природных полимеров (хитозан, альгинат, коллаген), а также биокомпозитные материалы (табл. 3).

Таблица 3. Классы биоматериалов, применяемых в тканевой инженерии.

Биоматериал	Биосовмести- мость (включая цитотоксичность)	Токсичность	Резорбция	Область применения
Синтетические: Полимеры на основе органических кислот Гидроксиапатит			Полная до СО 2 и Н 2 О Нерезорбируемый	Хирургия, в тканевой инженерии как матрица-носитель практически для всех культур клеток. Костная ткань
Природные: Альгинат				Перевязочные материалы, в тканевой инженерии в виде гидрогелей (хондробласты, нервные клетки)
				Перевязочные материалы, в ТИ в виде пленок, губок; в сочетании с коллагеном (реконструкция костной, мышечной, хрящевой тканей, сухожилий)
Коллаген			Замещение собственными белками, ферментативный лизис	Перевязочные материалы, в ТИ (губки, трехмерные модели, пленки) как матрица-носитель практически для всех культур клеток.
Внеклеточный матрикс (естественные биологические мембраны)	++++ (за счет включенных в структуры биологически активных веществ и факторов роста)		Ремоделирование с заменой собственными белками	Шовный материал, в ТИ (трехмерные модели, пленки) как матрица-носитель для практически всех культур клеток

Одними из первых в тканевой инженерии стали применяться биодеградируемые синтетические биоматериалы на основе полимеров органических кислот, например молочной (PLA, полилактат) и гликолевой (PGA, полигликолид). При этом в состав полимера может входить как один тип кислотного остатка, так и их сочетания в различных пропорциях. Матрицы на основе органических кислот легли в основу создания таких органов и тканей, как кожа, кость, хрящ, сухожилие, мышцы (поперечно-полосатая, гладкая и сердечная), тонкая кишка и др. Однако у этих материалов имеются недостатки: изменение рН окружающих тканей при расщеплении в организме и недостаточная механическая прочность, что не позволяет использовать их как универсальный материал для матриц и подложек.

Особое место среди материалов для биоматриц-носителей занимают коллаген, хитозан и альгинат.

Коллаген практически не имеет антигенных свойств. Использованный в качестве матрицы, он разрушается за счет ферментативного гидролиза и структурно замещается собственными белками, синтезируемыми фибробластами. Из коллагена могут быть изготовлены матрицы с заданными свойствами для реконструкции практически любых органов и тканей. Являясь естественным тканевым (межклеточным) белком, он оптимально подходит в качестве носителя культуры клеток, обеспечивая рост и развитие ткани.

Альгинат – полисахарид из морских водорослей, может быть использован в качестве матрицы-носителя, однако не обладает достаточной биологической совместимостью и оптимальными механическими свойствами. Обычно он используется в виде гидрогелей для восстановления хрящевой и нервной ткани.

Хитозан – азотсодержащий полисахарид, который является основной составляющей наружного покрова насекомых, ракообразных и паукообразных. Этот биоматериал получают из хитиновых панцирей ракообразных и моллюсков. В настоящее время заслуживает внимания комбинированный по составу препарат – коллагеново-хитозановый комплекс. В ходе лабораторных и клинических исследований была показана его инертность и способность сохранять жизнеспособность клеточной культуры как in vitro , так и in vivo . Этот комплекс разрешен Минздравом РФ в качестве перевязочного, ранозаживляющего средства и уже используется в клинической практике в хирургии и стоматологии.

Современные возможности тканевой инженерии

Большинство исследований в области тканевой инженерии направлены на получение того или иного эквивалента тканей. Самое изученное направление тканевой инженерии – реконструкция соединительной ткани, особенно костной. В первой работе в этой области была описана реконструкция костно-хрящевого фрагмента бедренной кости кролика. Основной проблемой, с которой столкнулись исследователи, был выбор биоматериала и взаимодействие костной и хрящевой тканей в графте. Эквиваленты костной ткани получают путем направленной дифференцировки стволовых клеток костного мозга, пуповинной крови или жировой ткани. Затем полученные остеобласты наносят на различные материалы, поддерживающие их деление, – донорскую кость, PGA, коллагеновые матрицы, пористый гидроксиапатит и др. Графт сразу помещают в место дефекта или предварительно выдерживают в мягких тканях. Основной проблемой таких конструкций исследователи считают несоответствие скорости образования кровеносных сосудов в новой ткани и сроков жизни клеток в глубине графта. Для решения этой проблемы графт размещают около крупных сосудов.

Гистогенез мышечных тканей в большой степени зависит от развития нервно-мышечных взаимодействий. Отсутствие адекватной иннервации конструкций мышечных тканей пока не позволяет создать функционирующие тканевые эквиваленты поперечно-полосатой мышечной ткани. Гладкая мускулатура менее чувствительна к денервации, т.к. имеет некоторую способность к автоматизму. Гладкомышечные тканевые конструкции используют при создании таких органов, как мочеточник, мочевой пузырь, кишечная трубка. В последнее время все большее внимание уделяется попыткам реконструкции сердечной мышцы с помощью графтов, содержащих сердечные миоциты, полученные путем направленной дифференцировки малодифференцированных клеток костного мозга.

Одним из самых важных направлений в тканевой инженерии является изготовление эквивалентов кожи. Живые эквиваленты кожи, содержащие донорские или собственные кожные клетки, в настоящее время широко применяются в США, России, Италии. Эти конструкции позволяют улучшить заживление обширных ожоговых поверхностей.

Основными точками приложения тканевой инженерии в кардиологии можно считать создание искусственных клапанов сердца, реконструкцию крупных сосудов и капиллярных сетей. Имплантаты из синтетических материалов недолговечны и часто приводят к образованию тромбов. При использовании трубчатых (сосудистых) графтов на биодеградируемых матрицах получены положительные результаты в экспериментах на животных, однако нерешенной проблемой остается контролируемая прочность и сила сопротивления стенок графта пульсовому давлению крови.

Создание искусственных капиллярных сетей актуально при лечении патологий микроциркуляции крови при таких заболеваниях, как облитерирующий эндартериит, сахарный диабет и др. Положительные результаты здесь получены при использовании биодеградируемых графтов, выполненных в виде сосудистой сети.

Восстановление органов дыхания, таких как гортань, трахея и бронхи, также возможно с помощью тканевых конструкций из биодеградируемых или композитных материалов с нанесенными на них эпителиальными клетками и хондробластами.

Заболевания и пороки развития тонкого кишечника, сопровождающиеся его значительным укорочением, приводят к тому, что пациенты вынуждены пожизненно получать специальные питательные смеси и парентеральные растворы. В таких случаях удлинение функциональной части тонкого кишечника – единственная возможность облегчить их состояние. Алгоритм изготовления графта сводится к следующему: на биодеградируемую мембрану наносятся клетки эпителиального и мезенхимального происхождения и помещаются в сальник или брыжейку кишки для созревания. Спустя определенное время собственную кишку соединяют с графтом. Эксперименты на животных показали улучшение всасывающей активности, однако из-за отсутствия иннервации искусственная кишка не обладает способностью к перистальтике и регуляции секреторной активности.

Основная сложность в тканевой инженерии печени заключается в формировании трехмерной структуры ткани. Оптимальной биоматрицей для клеточной культуры является внеклеточный матрикс печени. Исследователи полагают, что к успеху приведет применение пористых биополимеров с заданными свойствами. Предпринимаются попытки применения постоянного магнитного поля для трехмерной организации клеточной культуры. Остаются нерешенными проблемы кровоснабжения больших по размерам графтов и отвода желчи, поскольку в графтах отсутствуют желчные протоки. Однако существующие методики уже позволяют компенсировать некоторых генетические аномалии печеночных ферментных систем, а также ослабить проявления гемофилии у лабораторных животных.

Конструирование желез внутренней секреции находится на стадии экспериментальной проверки методик на лабораторных животных. Наибольшие успехи достигнуты в тканевой инженерии слюнных желез, получены конструкции, содержащие клетки поджелудочной железы.

Пороки развития мочевыделительной системы составляют до 25% всех пороков развития. Тканевая инженерия в этом направлении медицины очень востребована. Создание эквивалентов почечной ткани – достаточно сложная задача, и решить эту проблему пытаются с помощью технологий прямого органогенеза, используя эмбриональные закладки почечной ткани. На лабораторных животных была показана возможность восстановления различных органов и тканей мочевыделительной системы.

Одной из важнейших задач является восстановление органов и тканей нервной системы. Тканеинженерные конструкции могут быть использованы для восстановления как центральной, так и периферической нервной системы. В качестве клеточного материала для репарации спинного мозга могут быть использованы клетки обонятельных луковиц и трехмерные биодеградируемые гели. Для периферической нервной системы используют биодеградируемые трубчатые графты, внутри которых рост аксона осуществляется по шванновским клеткам.

Создание искусственных органов позволит отказаться от трансплантации большей части донорских органов, улучшит качество жизни и выживаемость пациентов. В ближайшее время эти технологии будут внедряться во все области медицины.

По материалам журнала «Клеточная трансплантология и тканевая инженерия», 2005, № 1

- Заруи Ивановна, говорят, что тканевая инженерия воплощает фантастику в жизнь. Над какими фантастическими проектами работает сегодня ваша лаборатория?

Тканевая инженерия - это конструирование и выращивание живых функциональных тканей или органов вне организма для последующей трансплантации пациенту. На месте дефекта должна быть восстановлена трехмерная структура ткани. Целью является регенерация ткани, а не просто замещение ее синтетическим материалом. Основная направленность нашей лаборатории - создание коллекции мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани взрослых людей. Эмбриональные стволовые клетки выделяются из внутренней клеточной массы зародыша на ранней стадии, а взрослые - из разных тканей взрослого организма. Существует этическая проблема, связанная с неизбежным разрушением эмбриона человека при получении эмбриональных стволовых клеток. Поэтому предпочтительнее получение клеток из ткани взрослого организма. Возможно, лет 20 назад это действительно могло восприниматься как фантастика, но сегодня это современная инновационная технология. Именно этим мы и занимаемся. Протоколы, привезенные из США (а я работала десять лет в лаборатории университета им. Джорджа Вашингтона), позволяют нам не разрабатывать методику с нуля, а продолжать работу в этом направлении.

- Какие задачи стоят перед лабораторией в Институте физиологии?

В Институте физиологии уже достаточно давно проводятся исследования на уровне организмов и внеклеточных моделей. Клеточная культура и тканевая инженерия предоставляют возможность развивать эту область, изучать молекулярные механизмы преобразования клеток в ткани, выращенных специально для дальнейшей трансплантации. Мы (а это я и трое моих молодых сотрудников), работаем в лаборатории с жировой (адипозной) тканью, из которой относительно легко выделяются стволовые клетки. Из них можно вырастить клетки сердечной ткани - кардиомиоциты с заданной структурой, функционально активные, способные к сокращению, а также нервные и кожные клетки в зависимости от цели исследования. Наша лаборатория пока владеет не всеми этими методиками, но они опубликованы, так что это дело времени.

В тканевой инженерии есть два основных компонента. Это клетки и среда, в которой они должны расти. Предположим, мы уже умеем делать из стволовой клетки мышечную клетку и клетку сердечной мышцы, которая отличается от обычной мышцы, а также клетки кожи, печени. Но и этого недостаточно, им необходима среда обитания. И не просто жидкая среда, а трехмерное пространство, в котором могут расти клетки для создания искусственной ткани. Необходим и специальный носитель клеток, так называемый матрикс. Для создания матриксов применяют биологические инертные материалы, одним из которых является коллаген. В последние пять-шесть лет широкое развитие получило создание естественных или, как их еще называют, обесклеточных матриксов. Объясню, что это такое. Каждая наша ткань, каждый наш орган имеют свою архитектуру. Исследования, проведенные в крупных научных центрах США и Японии, показали, что можно взять орган и отмыть его от всех клеток, сохранив при этом его архитектуру. Главное - обеспечить условия, при которых приготовленный заранее раствор, основным компонентом которого является детергент (мыло), протекал через все питающие этот орган сосуды, растворяя мембраны клеток и оставив лишь белковый остов. Чтобы удостовериться, что мы тоже можем это сделать, мы взяли сердце крысы, обработали его раствором детергента и по окончании эксперимента остался только каркас - мраморное сердечко. Вся архитектура органа, а она построена из белка, сохранилась. Мыло, как известно, на белок не действует. Клеточки, которые потом прокапываются изнутри, застревают в этом уже сложенном сердце, создают свои обратные связи и сердце начинает работать.

Конечно, сейчас пришли новые технологии, развивается биопечать, так называемая 3Д печать, которая позволяет напечатать матрикс или сердце. Но для этого надо дать принтеру специальные дорогостоящие "чернила". Сделать его из бумаги тоже не получится, матрикс не будет держаться. Чтобы он держался, необходимо выделить или синтезировать специализированные белки, в основном коллагены, которые создают архитектуру любого органа. В наших условиях это очень дорогая задача, легче получить обесклеточный орган. Но, предположим, мы все это собрали и ретрансплантировали, например, поставили заплатку на коже, но тут можем столкнуться с классической проблемой трансплантации - отторжением. Поэтому мы являемся лабораторией не просто тканевой инженерии, но и иммунологии.

Теоретически все клетки любого организма похожи и отличаются лишь поверхностными молекулами, которые кодируются молекулами, известными данной иммунной системе. Если смыть эти молекулы вместе с несущими их клетками, то теоретически матрикс не должен вызывать иммунную реакцию организма. Но никто этих исследований пока не делал.

Следующий этап - определить самые легкодоступные, дешевые, но работающие матрицы. Это второе направление нашей исследовательской деятельности. Оба направления мы пытаемся свести в одно, чтобы исследовать фундаментальные аспекты регенерации ткани. Иногда фундаментальную науку считают оторванной от действительности, но результаты исследования нашей лаборатории имеют конкретное приложение. Фрагменты ткани, выращенные в основном из кожи, наиболее легко приживаются при трансплантации. В США, Японии, Европе они широко используются при ожогах, пластических операциях и т.д., что со временем будет делаться и у нас. Но это будет уже вне академической организации.

- Наука Армении финансируется по остаточному принципу. Создать новую лабораторию иммунологии и тканевой инженерии требует немалых вложений. Как это удалось?

Приходится, конечно, выкручиваться. Идея создания лаборатории возникла благодаря инициативе Института физиологии и коллаборации с университетом им. Джорджа Вашингтона в США, где я остаюсь членом кафедры. Американские коллабораторы помогают всем, чем могут, делятся и оборудованием, реагентами. Заведующая лабораторией кардиофизиологии этого университета, ученый с мировым именем и наша соотечественница - профессор Нарине Сарвазян, заинтересованная, чтобы у нас тут все состоялось, помогает не только финансово, но и интеллектуально. Мы обговариваем идеи, изыскиваем варианты, чтобы получить результаты при очень скромных финансовых возможностях. Иногда она даже повторяет наш эксперимент в своей лаборатории, чтобы уточнить результат. Для выращивания клеток мы используем инкубатор старого советского образца. Институт выделил нам два компьютера, отремонтировал комнаты, выделенные лаборатории, предоставил пару старых стерильных боксов, хотя и не того уровня, что требуется, поэтому мы часто пользуемся аппаратурой лаборатории Наиры Айвазян, с которой активно сотрудничаем. Холодильник приобрели сами. В вопросе оснащения у нас пока еще много проблем, особенно необходим новый инструментарий. Из-за отсутствия прибора проточный цитометр не получается продуктивно сотрудничать с нашим коллаборатором - косметическим центром "Авангард" в Аване. Но мы расширяем контакты и исследовательские возможности.

Мои друзья, московские биологи, уверяли, что клетки - дамы капризные, и с ними необходимо разговаривать, иначе они обидятся и перестанут расти. Клетки обычно выделяются из женских особей, их надо любить. Придя утром в лабораторию, надо подойти к инкубатору и пожелать клеткам доброго утра, сказать что-то приятное, поговорить. Вы смеетесь, но это так. В университете им. Джорджа Вашингтона у меня был коллега, который игнорировал это правило, и клетки у него не росли. Ему пришлось обязать своих аспирантов каждое утро подходить к инкубатору и делать клеткам комплименты. Кроме того, клетке нужна наша защита. Взяв клетку из организма, мы лишаем ее иммунитета, теперь она рассчитывает только на нас и стерильную технику. Стерильность, которую мы должны обеспечивать, хирургам даже не снилась.

- С кем еще сотрудничает лаборатория?

Внутри института мы сотрудничаем с лабораториями Наиры Айвазян и Армена Восканяна. Они проводят свои исследования на биохимическом уровне или синтетических субстратах - отделяют жир, создают из него искусственное подобие клетки, формируют везикулы и на них исследуют влияние различных токсинов. Лучше это делать на растущих клетках. Поэтому еще одно направление деятельности лаборатории - изучение влияния наших эндемических ядов на активно растущие клетки. Не важно раковые это, эмбриональные или сердечные клетки. Не зная молекулярную физиологию действия ядов, не зная молекулярного механизма, создать конкретное противоядие сложно. Только поняв, какая молекула влияет на этот механизм, можно применять противоядие. Поэтому и отвечать на вопрос, почему взяли именно эту молекулу, надо на молекулярном уровне.

- Биотехнологии - наука очень дорогая, но обычно ученых выручают гранты...

Мы получили грант Госкомитета по науке, он рассчитан на два года. Но сумма не очень значительна. Надеялись получить и грант МНТЦ. Наладили коллаборацию с коллегами из Казахстана, где сейчас базируется МНТЦ, создали связь, но не получилось. Почему, не знаю. Отсутствует обратная связь. А мы на эти деньги рассчитывали.

) — создание новых тканей и органов для терапевтической реконструкции поврежденного органа посредством доставки в нужную область опорных структур, молекулярных и механических сигналов для регенерации.

Описание

Обычные имплантаты из инертных материалов могут устранить только физические и механические недостатки поврежденных тканей. Целью тканевой инженерии является восстановление биологических (метаболических) функций, т. е. регенерация ткани, а не простое замещение ее синтетическим материалом.

Создание тканеинженерного имплантата (графта) включает несколько этапов:

1. отбор и культивирование собственного или донорского клеточного материала;
2. разработка специального носителя для клеток (матрицы) на основе биосовместимых материалов;
3. нанесение культуры клеток на матрицу и размножение клеток в биореакторе со специальными условиями культивирования;
4. непосредственное внедрение графта в область пораженного органа или предварительное размещение в области, хорошо снабжаемой кровью, для дозревания и формирования микроциркуляции внутри графта (префабрикация).

Клеточный материал может быть представлен клетками регенерируемой ткани или стволовыми клетками. Для создания матриц графтов применяют биологически инертные синтетические материалы, материалы на основе природных полимеров (хитозан, альгинат, коллаген), а также биокомпозитные материалы. Например, эквиваленты костной ткани получают путем направленного дифференцирования стволовых клеток костного мозга, пуповинной крови или жировой ткани. Затем полученные остеобласты (молодые клетки кости, отвечающие за ее рост) наносят на различные материалы, поддерживающие их деление, - донорскую кость, коллагеновые матрицы, пористый гидроксиапатит и др. Живые эквиваленты кожи, содержащие донорские или собственные кожные клетки, в настоящее время широко применяются в США, России, Италии. Эти конструкции позволяют улучшить заживление обширных ожоговых . Разработка графтов ведется также в кардиологии (искусственные клапаны сердца, реконструкция крупных сосудов и капиллярных сетей); для восстановления органов дыхания (гортань, трахея и бронхи), тонкого кишечника, печени, органов мочевыделительной системы, желез внутренней секреции и нейронов. металлов в тканевой инженерии используются для контроля роста клеток через воздействие на них магнитными полями разной направленности. Например, таким способом удалось создать не только аналоги структур печени, но и такие сложные структуры, как элементы сетчатки глаза. Также материалы, созданные с помощью метода (electron beam lithography, EBL), обеспечивают наноразмерную поверхности матриц для эффективного формирования костных имплантантов. Создание искусственных тканей и органов позволит отказаться от трансплантации большей части донорских органов, улучшит качество жизни и выживаемость пациентов.

Авторы

• Народицкий Борис Савельевич
• Нестеренко Людмила Николаевна

Источники

1. Нанотехнологии в тканевой инженерии // Нанометр. -www.nanometer.ru/2007/10/16/tkanevaa_inzheneria_4860.html
2. Стволовая клетка // Википедия, свободная энциклопедия.www.ru.wikipedia.org/wiki/Стволовые_клетки (дата обращения: 12.10.2009).

Тканевая инженерия — молодое и развивающееся направление медицины, открывающее перед человечеством новые возможности. Профессия подходит тем, кого интересует химия и биология (см. выбор профессии по интересу к школьным предметам).

В этой статье мы расскажем вам о профессии тканевого инженера — одной из профессий будущего в этом направлении.

Что такое тканевая инженерия?

Это наука, возникшая на границе между клеточной биологией, эмбриологией, биотехнологией, трансплантологией и медицинским материаловедением.

Она специализируется на разработке биологических аналогов органов и тканей, создаваемых из живых клеток и предназначенных для восстановления или замещения их функций.

Кто такой тканевый инженер?

Это специальность, которая станет востребована в ближайшем будущем. В обязанности этого профессионала входит разработка и контроль производственного процесса, подбор материалов и формирование необходимых условий для создания тканеинженерных имплантов (графтов) и их дальнейшей трансплантации. По некоторым данным, эта профессия начнет распространяться после 2020 года.

Разработка и внедрение графта включает в себя ряд стадий:

— вначале необходимо произвести отбор и культивацию клеток;

— затем создается клеточный носитель (матрица) с использованием биосовместимых материалов;

— после этого клетки размещаются на матрице и происходит их размножение в биореакторе;

— наконец имплант помещается в область нефункционирующего органа. При необходимости перед этим графт внедряется в область с хорошим кровоснабжением для его созревания (этот процесс называется префабрикацией).

Исходным материалом могут послужить клетки ткани, которую необходимо регенерировать, или стволовые клетки. При производстве матриц могут применяться различного рода материалы (биокомпозитные, синтетические биологически инертные, природные полимерные).

Где применяются графты

• Создание искусственных аналогов кожи, помогающих в регенерации кожного покрова при обширных ожогах.
• Тканеинженерные импланты также обладают большим потенциалом в области кардиологии (биологические аналоги сердечных клапанов, воссоздание артерий, вен и капилляров).
• Кроме того, они применяются при воссоздании дыхательной системы, органов пищеварения, мочевой системы, желез внешней и внутренней секреции.

Где учиться на тканевого инженера

В данный момент в нашей стране нет образовательных программ, проводящих обучение по данной специальности, существует лишь ряд лабораторий при научно-исследовательских институтах, специализирующихся на тканевой инженерии. Специалисты, желающие развиваться в этой области, могут получить базовое медицинское образование. Также следует рассмотреть возможность обучения за рубежом: в США и Европе активно развиваются магистратуры по данной специальности.

Профессионально важные качества:

• системность мышления;
• интерес к работе в междисциплинарной области;
• готовность к работе в условиях неопределенности;
• научно-исследовательский интерес;
• отовность к командной работе.

Профилирующие дисциплины:

• биология;
• химия;
• физика;
• математика;
• информатика.

Достижения современной тканевой инженерии

Были созданы и успешно применены аналоги сосков женской груди, тканеинженерный мочевой пузырь и мочеточники. Ведутся исследования в области создания печени, трахеи и элементов кишечника.

Ведущие научно-исследовательские лаборатории работают над воссозданием другого с трудом поддающегося восстановлению человеческого органа — зуба. Сложность заключается в том, что клетки зуба развиваются из нескольких тканей, сочетание которых не удавалось воспроизвести. В настоящее время не полностью воссозданы только ранние этапы формирования зуба.Создание искусственного глаза в настоящее время находится на начальном этапе, однако уже получилось разработать аналоги отдельных его оболочек — роговицы, склеры, радужки.

В то же время, вопрос о том, как интегрировать их в единое целое, пока остается открытым.

Группе немецких ученых из университета г. Киля удалось успешно восстановить нижнюю челюсть пациента, почти целиком удаленную в связи с опухолью.

Стволовые клетки пациента вместе с факторами роста кости поместили в точную копию его челюсти, созданную из титановой сетки. Затем на период инкубации эту конструкцию на 8 недель поместили в его мышцу под правой лопаткой, откуда затем она была пересажена пациенту.

Пока преждевременно говорить о том, насколько эффективно будет функционировать такая челюсть. Однако это первый достоверный случай пересадки кости, буквально выращенной внутри человеческого организма.

В будущем, как говорят фантасты, для излечения от недуга нужно будет всего лишь зайти в аптеку, похожую на склад с запчастями. И выбрать нужную полку. Вот здесь — запасные глаза, вот — печень, почки, а в этом ящике — руки и ноги разных размеров… Не отстают от писателей и голливудские фантазеры, они тоже подливают масла в огонь этой темы: эффектно отрастающие новые руки и ноги супергероев впечатляют. Но в жизни, разумеется, все гораздо прозаичнее, нежели на экране. Хотя некоторые предпосылки к тому, чтобы в скором времени человек «примерил» биоискусственные органы, уже есть.

Тканевая инженерия — активно развивающаяся отрасль медицины и биологии — буквально воплощает фантастику в жизнь. Специалисты, занятые в этой области, изучая строение живых тканей, пытаются вырастить их в лабораторных условиях, чтобы затем использовать искусственно созданную ткань для трансплантации. Такое «производство» откроет очень серьезные перспективы. Стоит только вдуматься в это: заболевший (раненый, покалеченный) человек сможет быстро восстанавливаться, он получит неисчерпаемый источник для замены поврежденных органов. Ведь современные темпы урбанизации и развитие технических средств, как ни странно, подвергают жителей Земли все большим опасностям и болезням, всевозможным травмам в различных катастрофах, так что задача тканевых инженеров действительно широка — вырастить кости, хрящи и органы для замены поврежденных.

Как и все разделы медицины, тканевая инженерия имеет собственную терминологию и свои методологические подходы. Любая «тканеинженерная» процедура начинается с получения исходного клеточного материала — первого шага. Как правило, для этого проводят биопсию, то есть забирают у пациента, нуждающегося в биоискусственной ткани, клетки нужного типа. Однако не все клетки могут достаточно интенсивно размножаться в искусственной среде. Поэтому другой подход состоит в том, чтобы отобрать недифференцированные клетки-предшественники, так называемые стволовые клетки , которые будут созревать и специализироваться уже в лабораторных условиях. Этим определяется взаимосвязь тканевой инженерии с исследованиями стволовых клеток. Однако не следует отождествлять эти два направления биомедицинских исследований — тканевые инженеры работали над своими проектами еще задолго до того, как термин «стволовые клетки» стал знаком широкой публике.

Второй шаг — культивирование полученных клеток в лабораторных условиях (in vitro) с целью увеличить во много раз их количество. При этом в случае использования недифференцированных (стволовых) клеток они помещаются в специальную среду, которая индуцирует их превращение в клетки строго заданного вида. Чтобы понять, насколько это сложно, достаточно сказать, что в организме насчитывается более 200 разновидностей клеток. Для достижения нужного результата культивирование проводится в специальных биореакторах. В них не только моделируется состав газовой смеси и набор веществ в питательной среде, но и поддерживаются необходимые для развития клеток и тканей физические параметры — освещенность, течение или пульсация жидкости, гравитация и т. п.

Но для выращивания живой ткани мало просто получить достаточное количество нужных клеток, необходимо, чтобы они были надлежащим образом организованы в пространстве. Поэтому следующим шагом становится формирование трехмерного каркаса — носителя для искомой ткани, на котором они бы могли нормально развиваться и выполнять свои функции после пересадки в организм.

Наконец, в итоге всех этих сложных манипуляций появляется готовый биоискусственный эквивалент ткани — графт, и тогда наступает последний этап — его имплантация в тело пациента (графтинг). Использование собственных клеток пациента для изготовления графта — основополагающий принцип тканевой инженерии. Забирая аутоклетки, врачи избегают иммунологических проблем — отторжения пересаженного материала, благодаря чему шансы на удачный исход операции резко возрастают.

У истоков тканевой инженерии
Если не считать сотворения Евы из ребра Адама, то выращивание клеток и тканей началось на закате XIX века. В 1885 году немецкий эмбриолог Вильгельм Ру в течение нескольких дней смог поддерживать жизнеспособность фрагмента куриного эмбриона в искусственных условиях. Однако настоящих успехов в культивировании тканей вне организма удалось достичь только после экспериментов Р. Гаррисона в 1907 году: он предложил использовать свернувшуюся кровь или лимфу в качестве среды для развития тканей в лабораторной посуде — in vitro.

В Россию этот метод пришел в 1913 году, когда сотрудник Императорской Военно-медицинской академии П.П. Авроров и его коллега А.Д. Тимофеевский смогли в течение некоторого времени выращивать клетки лейкозной крови. А годом позже этой проблемой заинтересовался великий российский гистолог Александр Александрович Максимов, профессор той же академии, который не только подтвердил данным методом унитарную теорию кроветворения, то есть доказал, что все клетки крови развиваются из общего предшественника — стволовой клетки, но и заложил основу для дальнейших разработок в области культивирования тканей вне организма. На базе его результатов были выполнены сотни работ по выращиванию клеток соединительной ткани и крови, созданию тканеинженерных эквивалентов костной ткани. Его приоритет в этих исследованиях признан всемирно.

Настоящая же эра тканевой инженерии, да и собственно выделение ее как самостоятельной отрасли медицины, началась с дерзких работ К. Ваканти по совмещению в лабораторных условиях живых клеток и искусственных носителей для них, которые он предпринял в 80-х годах прошедшего столетия. На сегодня, пожалуй, не осталось ни одного человеческого органа, развитие и регенерацию которого тканевые инженеры не пытались бы «приручить».

Основа ткани

Выбор носителя для развития искусственной ткани — одна из самых серьезных проблем тканевой инженерии. Его материал должен быть безопасным как для тех клеток, которые на нем будут жить, так и в целом для организма, куда потом будет пересаживаться биоискусственная ткань. В идеале материал со временем полностью замещается тканью организма. При этом он должен иметь уникальную, характерную для данного типа ткани трехмерную организацию, которая воспроизводила бы структуру межклеточного матрикса живой ткани. Например, для воссоздания полых трубчатых органов используют лишенные жизнеспособных клеток участки аналогичных органов (кишечника, трахеи, мочеточников и мочевого пузыря), полученных от крупных животных. Но в качестве таких носителей могут быть применены другие, самые разнообразные и подчас весьма неожиданные материалы.

Проще всего (если, конечно, тут вообще уместно говорить о простоте) оказалось создать биоискусственные кости. В качестве источников клеток для будущих костей используют стволовые стромальные клетки костного мозга, которые могут развиваться в клетки разных тканей, а также остеогенные (способные образовывать костную ткань) клетки иного происхождения. Настоящее поле для фантазии представляется при выборе носителя для них. В ход идут коллагены различных типов, стеклокристаллические материалы, даже кораллы. Неплохой основой служат безжизненные (трупные) кости человека и животных, а также сложные синтетические конструкции, растворяющиеся за определенный срок в организме. В последнем случае основной проблемой является синхронизация процесса остеогенеза, то есть образования костной ткани в области ее дефицита и растворения привнесенной искусственной конструкции. На сегодняшний день по всему миру выполнено уже несколько тысяч хирургических вмешательств с использованием тканеинженерных эквивалентов костной ткани.

Весьма востребована на рынке медицинских услуг клеточная и тканевая реконструкция суставного хряща. Хрящ — особая ткань, которая в естественных условиях не регенерирует. По некоторым экспертным оценкам, рынок этих продуктов только в США может составлять сотни миллионов долларов в год.

Не обошли вниманием тканевые инженеры и кожу — самый большой орган на теле человека. Общая площадь кожного покрова взрослого мужчины достигает 2,5 м 2 при весе 15—20 кг (с учетом подкожной клетчатки). Кожа устроена достаточно сложно и выполняет ряд жизненно важных функций, вот почему при ее обширных повреждениях, помимо местных расстройств, могут наблюдаться и общие патологические проявления, подчас ставящие жизнь больного под угрозу. При сильных ожогах и длительно не заживающих язвах кожа неспособна сама восстанавливать свою целостность. На помощь приходят специалисты, у которых уже есть не только лабораторные прототипы, но и коммерческие образцы биоискусственной кожи. На сегодняшний день тысячи человек в мире уже успели воспользоваться услугами фирм, предлагающих на рынке медицинских услуг подобные тканевые препараты.

Но самых фантастических результатов достигли тканевые инженеры в детской практике. Растущий организм предъявляет особые требования к созданию тканеинженерных конструкций — ведь они должны расти вместе с организмом ребенка. Так, недавно немецкими учеными был создан тканеинженерный сердечный клапан. В качестве основы для клеток сосудистой стенки (эндотелия) был взят сердечный клапан взрослой свиньи. А источником клеточного материала стали клетки пуповинной крови ребенка. Между прочим, до недавнего времени пуповинную кровь при родах выбрасывали вместе с плацентой, но теперь все больше данных свидетельствует о том, что сохранение этих клеток в гемабанках в определенных случаях может дать шанс для спасения жизни человека.

Искусственная челюсть
Не так давно группа немецких специалистов из города Киль под руководством Патрика Варнке (Patrick Warnke) сообщила об успешном воссоздании нижней челюсти, которая была практически полностью удалена в связи с опухолевым поражением. Первоначально врачам пришлось создать титановый каркас челюсти, который был заполнен костным матриксом, костным мозгом пациента и факторами роста кости. Однако такой большой фрагмент не мог быть помещен сразу в область повреждения, ведь лишенные собственной сосудистой сети клетки костного мозга, в том числе и стволовые, не только бы не дифференцировались в остеобласты (клетки, продуцирующие костную ткань), но и погибли от кислородного голодания и отсутствия питательных веществ. Поэтому полученную конструкцию внедрили в мышцы спины. Это было сделано для того, чтобы в толще интенсивно снабжаемых кровью мышц сосуды сами проросли в толщу «биологического протеза». Когда это произошло, конструкцию извлекли и пересадили на должное место, предварительно соединив сосуды нижней челюсти и биопротеза микрохирургическим путем.

С каждым годом таких или подобных операций проводится все больше. Они позволяют не только восстановить функцию утраченного органа, но и обеспечить эстетический косметический эффект.

Сосуды — тканям!

Одним из факторов, ограничивающих фантазию тканевых инженеров, является невозможность создания относительно больших конструкций в связи с отсутствием их адекватного кровоснабжения и иннервации (связи с центральной нервной системой). Тканеинженерные конструкции, изъятые из искусственной среды, рискуют погибнуть из-за того, что в них нет кровеносных сосудов и в теле пациента они не будут в достаточной мере снабжаться питательными веществами. Частично эту проблему можно решить методом префабрификации — временного помещения созданной в лаборатории тканеинженерной конструкции под кожу или между мышц. Через некоторое время, когда сосуды прорастут весь объем графта, его выделяют с сохранением сосудов и переносят в область повреждения. Однако такой подход связан с нанесением пациенту дополнительной операционной травмы, поэтому тканевые инженеры нашли гениальное решение: биоискусственным тканям — биоискусственные сосуды! Первые работы были проведены с полимерными микротрубочками, выстланными изнутри эндотелием. Такие трубочки пронизывают всю толщу созданной в лаборатории ткани. Постепенно полимер рассасывается и не мешает обмену газами и питательными веществами между кровью и клетками.

На сегодняшний день уже практически ничто не ограничивает возможностей тканевых инженеров. Созданы не только лабораторные прототипы, но и применены в клинической практике тканеинженерные эквиваленты сосков молочных желез, биоискусственный мочевой пузырь, мочеточники. Определены методические подходы к созданию легких, печени, трахеи, участков кишечника и даже кавернозных тел полового члена.

Конструирование паренхиматозных органов — печени, легких и других — представляет особую сложность, поскольку все клетки в них находятся в тонкой взаимосвязи и должны строго занимать надлежащее им место в трехмерном пространстве. Неожиданные положительные результаты здесь проявились при выращивании клеток во взвешенном состоянии — без прикрепления к поверхности. Группа исследователей под руководством профессора Колина Макгуккина (Colin McGuckin) из Университета Ньюкасла, Великобритания, использовала вращающийся биореактор, разработанный 10 лет назад специально для Международной космической станции. Он позволяет имитировать на Земле условия невесомости и микрогравитации. Оказалось, что при культивировании в нем стволовых клеток пуповинной крови можно добиться не только их превращения в функционально активные клетки печени, но и органогенеза — образования аналога печеночной ткани с присущими ей функциями.

Не менее удивительные результаты дали опыты по насыщению культуры клеток металлическими наночастицами посредством липосом, беспрепятственно проникающих через клеточную мембрану. Пребывание таких структур внутри клетки практически не оказывает на нее влияния. Зато ученые получают возможность контролировать рост клеток, воздействуя на них магнитными полями разной направленности. Таким способом удалось создать не только аналоги структур печени, но и такие сложные структуры, как элементы сетчатки глаза. Разработки тканеинженерного глаза еще находятся в самых начальных стадиях, но уже удалось получить эквиваленты отдельных его частей — роговицы, склеры, радужки. Правда, проблема интеграции полученных частей пока не решена. Тем не менее в научной литературе можно встретить сведения о трансплантации светочувствительных клеток — палочек и колбочек — в «святая святых» глаза — сетчатку, правда, пока только в экспериментальных условиях.

Пожалуй, чтобы окончательно почувствовать себя всемогущими, тканевым инженерам осталось лишь научиться воссоздавать в лабораторных условиях сложные производные нервных зачатков.

В ведущих западных и отечественных лабораториях специалисты пытаются воспроизвести развитие и другого крайне трудного для восстановления органа — зуба. Трудности с его созданием вызваны тем, что составляющие зуба развиваются из различных источников: часть из производных нервной системы — нервного гребня, а часть из эпителиальной выстилки ротовой полости. Совместить эти источники in vitro длительное время не удавалось. На сегодняшний момент в искусственных условиях частично воспроизведены лишь ранние стадии развития зуба. Как правило, без помощи организма здесь не обойтись и после этапа лабораторной работы прообраз будущего зуба все равно приходится подсаживать в его естественное окружение — альвеолу челюсти (зубную лунку) — для полного «созревания» тканеинженерной конструкции.

В итоге можно сказать, что минувшее двадцатилетие ознаменовалось становлением новой отрасли биологии и медицины — тканевой инженерии. Специалисты, работающие в этой области, обладают поистине уникальными качествами. Они должны быть в равной степени и врачами, и биологами, а также иметь навыки хирурга. Таковых сейчас нигде не готовят, по крайней мере, в нашей стране. Как правило, тканевые инженеры — это энтузиасты, которые поставили перед собой цель претворить сказку из детства в реальность. Пока общечеловеческая проблема, которой они занимаются, далека от разрешения. Ежегодно сотни тысяч людей по всему миру погибают от хронических заболеваний, так и не дождавшись спасительной пересадки донорского органа. Сегодня, видимо, уже не найдется ученых, которые стали бы отрицать, что тканевая инженерия — это медицина будущего, успехи которой имеют колоссальное значение для всего человечества. Но вместе с тем сложно найти и такого специалиста, который безоговорочно призовет всех лечиться, прибегая к методам тканевой инженерии — слишком уж много вопросов и нерешенных проблем стоит перед этой очень перспективной областью знаний.

Сайты по теме
www.celltranspl.ru — Сайт «Клеточные технологии в медицине». Здесь же размещается электронный журнал «Клеточная трансплантология и тканевая инженерия».

www.gemabank.ru — Сайт банка стволовых клеток «Гемабанк» посвящен теме хранения и использования пуповинной крови.

organprint.missouri.edu — Сайт научной группы из Университета штата Миссури, США, посвященный напечатанным на специализированном принтере искусственным органам.